中藥淡豆豉的質量及其抗骨質疏松的物質基礎研究.pdf

1、目的:課題組前期研究發(fā)現(xiàn)淡豆豉有明顯的抗骨質疏松活性，并確認淡豆豉總黃酮為對抗骨質疏松的有效部位，但尚不清楚具體作用的有效成分。本研究采用紫外-可見分光光度法(UV法)測定不同產(chǎn)地淡豆豉總黃酮含量并進行性狀觀察比較，建立淡豆豉總黃酮的含量檢測方法，保證淡豆豉的質量;同時實驗室自己提取分離淡豆豉的有效成分，應用HPLC-ESI-MS/MS技術對其進行分析鑒定，使其獨立作用于體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞，從細胞水平觀察其對成骨細胞增殖的作用和相互作

2、用，進一步明確其物質基礎。
　　 方法:
　　 1、中藥淡豆豉的質量研究
　　 1.1、薄層色譜鑒別條件
　　 以三氯甲烷-甲醇-水(9∶2∶1)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，點于硅膠GF254薄層板上，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。
　　 1.1.1、淡豆豉中輔料桑葉、青蒿的鑒別
　　 1.1.1.1、薄層條件
　　 點于硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-

3、甲酸(5∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。
　　 1.2、不同產(chǎn)地（含自制）淡豆豉的觀察及UV法對其中總黃酮含量的測定
　　 1.2.1、對不同產(chǎn)地淡豆豉性狀進行觀察，包括表面顏色、菌毛顏色等
　　 1.2.2、UV法對其中總黃酮含量的測定條件
　　 以染料木素為對照，樣品測定以0.01mol/LNaOH溶液為空白溶液，在261nm處測吸收度，并繪制標準曲線。
　

4、　 1.3、HPLC法測定淡豆豉中大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木素和染料木苷含量
　　 1.3.1、色譜條件
　　 HPLC梯度洗脫梯度為:0-10min，13％A，87％B;10-40min，25％A,75％B∶40-55min,30％A,70％B;55-65min,80％A,20％B。流量為1mL/min;檢測波長為261nm，柱溫為室溫，進樣量為25μL。
　　 1.4、利用液質聯(lián)用技術HP

5、LC-ESI-MS分析鑒定淡豆豉中黃酮類成分
　　 1.4.1、色譜條件
　　 HPLC線性洗脫梯度為:0-10min，13％A，87％B;10-40min，25％A,75％B:40-55min,30％A,70％B;55-80min,80％A,20％B。流量為150μL/min;柱溫為室溫。進樣量為0.3μL。
　　 1.4.2、質譜條件
　　 采用正、負離子檢測方式。噴霧電壓4.0-5KV;毛細管電壓+

6、15或-20;毛細管溫度300℃;鞘氣流速:40arb;輔助氣流速:50arb;管透鏡補償電壓:+18或-40;一級質譜掃描范圍m/z300-1500;碰撞能量:30％-40％。
　　 1.5、淡豆豉化學成分研究
　　 1.5.1、淡豆豉的制備方法
　　 取安國黑豆20kg，挑洗晾干。稱取青蒿桑葉各10kg，蒸煮發(fā)酵置于烘箱內37℃，放置7天，取出，即淡豆豉。
　　 1.5.2、淡豆豉活性成分提取

7、　　 取淡豆豉約20kg，用石油醚脫脂，75％的乙醇回流提取，收集上清液，濃縮，留浸膏。
　　 1.5.3、淡豆豉活性成分的分離
　　 1.5.3.1、淡豆豉活性成分的粗分
　　 將提取后得到的浸膏，分別一次用乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，收集上清液，濃縮，得到的浸膏。
　　 1.5.3.1.1、乙酸乙酯部分的粗分
　　 將揮干后的乙酸乙酯層稱重，用石油醚和乙酸乙酯溶解后與硅膠拌樣，置于大的布氏漏斗

8、內，分別用石油醚、石油醚和乙酸乙酯不同比例、乙酸乙酯、乙酸乙酯和甲醇比例、甲醇進行淋洗，分別合并濾液，濃縮，得浸膏。
　　 1.5.3.1.2、正丁醇部分的粗分
　　 將烘干的正丁醇部分稱重，上大孔樹脂柱，并用不同濃度的乙醇進行沖洗，分別合并流出液，濃縮，留渣。
　　 1.5.3.2、乙酸乙酯層的細分
　　 將以上得到的乙酸乙酯部分，分別通過硅膠、MCI、以及反相C-18柱，并結合薄層技術進行分離。

9、>　　 1.5.4、淡豆豉化學成分結構的鑒定
　　 將以上得到的各種單體與黃酮對照品，應用核磁技術，對所得單體的結構進行鑒定。
　　 2、抗骨質疏松的物質基礎研究
　　 2.1、淡豆豉化學成分對成骨細胞的增殖影響
　　 2.1.1、大鼠顱骨成骨細胞(OB)原代培養(yǎng)與鑒定
　　 依據(jù)改良的組織塊法，分離培養(yǎng)新生（24h內）SD大鼠顱骨成骨細胞。用堿性磷酸酶染色方法來鑒定成骨細胞，并在倒置顯微鏡下觀

10、察細胞的形態(tài)。
　　 2.1.2、MTT法檢測淡豆豉化學成分對體外培養(yǎng)OB細胞的增殖影響
　　 將已確定的分離得到的不同單體樣品的濃度梯度設為(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)，作用時間為24h;MTT法測定各孔的存活率，以OD值表示。
　　 結果:
　　 1、薄層鑒別結果
　　 經(jīng)過薄層色譜鑒別可見，在供試品色譜與對照品色譜相應的位置上，顯示相同顏色的主斑點，斑點清晰

11、，Rf值符合要求。經(jīng)過薄層色譜鑒別，以桑葉和青蒿藥材作為對照，利用同一塊薄層板同一展開劑系統(tǒng)同一檢視方法同時進行鑒別，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯示相同顏色的主斑點，斑點清晰，分離效果理想。
　　 2、UV測定淡豆豉總黃酮含量結果
　　 其中含量最高的為山東鄄城（2011年）樣品5.14％，最低的為廣東陽江（2011年）樣品0.911％，兩者相差4倍。
　　 3、HPLC對淡豆豉中大豆苷、大豆苷

12、元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木素、染料木苷六種化合物含量的測定結果
　　 3.1、方法學考察結果
　　 3.1.1、線性關系
　　 以對照品濃度(μg/mL)(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。
　　 3.1.2、精密度試驗考察結果
　　 大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木素、染料木苷六種對照品含量RSD值分別為0.572％、0.829％、0.498％、0.831％

13、、0.773％、0.557％，表明儀器精密度良好。
　　 3.1.3、穩(wěn)定性試驗考察結果
　　 在檢測的48小時內，大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木素、染料木苷對照品溶液的含量穩(wěn)定，RSD值分別為0.562％、1.002％、0.636％、1.809％、1.194％、0.551％，穩(wěn)定性較好。
　　 3.1.4、重復性試驗考察結果
　　 由6次測定結果，對大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染

14、料木素、染料木苷的含量測定，其RSD值分別為1.553％、2.198％、2.158％、1.838％、1.731％、1.759％，說明方法的重現(xiàn)性良好。
　　 3.1.5、回收率試驗考察結果
　　 加樣回收實驗表明，大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木素、染料木苷的平均回收率分別為100.620％、100.210％、100.510％、101.880％、98.599％、98.953％，RSD值分別為0.727％、2.

15、243％、0.944％、1.125％、1.376％、2.287％(n=9)，說明方法準確可靠。
　　 4、HPLC-ESI-MS/MS成分分析
　　 從HPLC-ESI/MS/MS總離子流圖和HPLC圖譜中可以看出，多數(shù)成分來自于原料黑豆，通過正、負離子碎片離子信息，鑒別出1個來自于桑葉中的黃酮Atalantoflavone，和2個來自于青蒿中的黃酮青蒿黃酮和芹菜素。其他黃酮均來自于原料藥黑豆，分別為大豆苷元、染料木素、

16、黃豆黃素3種黃酮及其及苷類成分。
　　 5、淡豆豉化學成分的研究
　　 5.1、淡豆豉中化合物結構的鑒定
　　 將從淡豆豉中提取分離的到得到的化合物，在核磁作用下對其進行了結構鑒定，分別為丁香酸syringicacid(Ⅰ)、大豆苷(Ⅱ)daidzin、大豆苷元daidzein(Ⅲ)、黃豆黃苷glycitin(Ⅳ)、黃豆黃素glycitein(V)、染料木素genistein(Ⅵ)、染料木苷genistin(Ⅶ)

17、、芹菜素Apigenin(Ⅷ)、β-谷甾醇β-sitosterol(Ⅸ)、菜油甾醇(StigmasterolⅩ)、豆甾醇Campesterol(Ⅺ)。
　　 5.2、淡豆豉化學成分對成骨細胞增殖的影響
　　 5.2.1、成骨細胞形態(tài)觀察和鑒定
　　 原代培養(yǎng)24h～36h，倒置相差顯微鏡下，可見自顱骨碎片爬出的成骨細胞，貼壁生長，呈放射狀短梭形或三角形，細胞排列無方向性。傳代細胞最初接種時呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中，

18、24h可見大部分細胞貼壁、伸展;培養(yǎng)3d后，OB形狀基本穩(wěn)定;培養(yǎng)5d左右細胞呈鋪路石狀。
　　 堿性磷酸酶染色:實驗用堿性磷酸酶染色后，顯微鏡下觀察可見胞漿內散在的紫藍色沉淀，呈典型的ALP染色陽性反應。細胞染色深淺不等，陽性細胞多為長梭形和鱗片形，成骨細胞堿性磷酸酶染色陽性率可達93％
　　 5.2.2、淡豆豉化學成分對成骨細胞的增殖影響
　　 5.2.2.1、大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黃豆黃素1

19、0-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L時，MTT檢測結果顯示，大豆苷元、大豆苷、染料木苷、染料木素、黃豆黃素各藥物組濃度在10-9、10-8、10-7、10-6mol/L時，隨濃度的增加，細胞增殖明顯，對細胞的增殖作用大豆苷元、染料木素、黃豆黃素優(yōu)于大豆苷、染料木苷。但在10-5mol/L時出現(xiàn)一定的細胞毒性。
　　 結論:
　　 1、應用UV法對來自14個不同產(chǎn)地以及自制淡豆豉總黃酮含量測定，其結果表

20、明不同產(chǎn)地淡豆豉主要成分的含量差異也很大。此外，相同產(chǎn)地不同存放時間的淡豆豉含量差異也很大。
　　 2、淡豆豉中提取分離得到11種化合物，經(jīng)過結構鑒定以及液質的成分分析，可確定其分別為大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木素、染料木苷、丁香酸、芹菜素及植物甾醇類，對其中的大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木素及染料木苷六種化合物利用HPLC方法進行含量測定，并進一步對六種化合物進行活性研究
　　 3、大豆苷

21、元、大豆苷、染料木苷、染料木素、黃豆黃素在10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L時，大豆苷元、大豆苷、染料木苷、染料木素、黃豆黃素各藥物對細胞的增殖活性與濃度在10-9～10-6mol/L呈現(xiàn)正相關趨勢，隨濃度的增加，細胞增殖明顯，但在10-5mol/L時出現(xiàn)一定的細胞毒性，提示:淡豆豉中提取得到的各黃酮類化合物，有明顯的細胞增殖，且對細胞的增殖作用大豆苷元、染料木素、黃豆黃素優(yōu)于大豆苷、染料木苷，淡豆豉具有較強的抗