雄芍湯抗肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、第一部分 雄芍湯有效部位的提取分離及含量測(cè)定
　　 目的：建立雄芍湯的提取方法,以及其總提取物中粗多糖、總苷、總生物堿三個(gè)有效部位的分離和含量測(cè)定方法。
　　 方法：以水煎煮法作為雄芍湯的提取方法。采用醇沉法,并結(jié)合Sevage法除蛋白,以分離粗多糖;采用水飽和正丁醇萃取法分離總苷;采用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法分離總生物堿。采用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定雄芍湯粗多糖提取物中總多糖的含量,以及總苷提取物中人參總皂苷的含量,采用高效液

2、相色譜法測(cè)定總苷提取物中芍藥苷的含量,采用酸堿滴定法測(cè)定雄芍湯總生物堿提取物中總堿的含量。
　　 結(jié)果：粗多糖提取物中總多糖含量為55.74％,平均回收率為98.23%,RsD為0.54%;總苷提取物中人參總皂苷的含量為63.54%,平均回收率為96.34%,RsD為0.61%;總苷提取物中芍藥苷的含量為10.01%,平均回收率為99.67%,RSD為1.38%;總生物堿提取物中總堿的含量為79.42%,平均回收率為101.12

3、%,RSD為3.37%。
　　 結(jié)論：雄芍湯的提取分離方法簡(jiǎn)便易行,其粗多糖提取物、總生物堿提取物與總苷提取物的含量測(cè)定方法靈敏度高,重現(xiàn)性好,可用于雄芍湯有效部位的質(zhì)量控制。
　　 第二部分 雄芍湯及其有效部位抗模型大鼠肝纖維化的作用及機(jī)理研究
　　 目的：采用二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,進(jìn)行雄芍湯及其三個(gè)有效部位(粗多糖、總生物堿和總苷)抗DMN誘導(dǎo)模型大鼠肝纖維化的藥效學(xué)觀察及其作用機(jī)理研究

4、,以初步闡明雄芍湯中發(fā)揮抗纖維化作用的物質(zhì)基礎(chǔ),為雄芍湯的開(kāi)發(fā)應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：將86只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱為正常組)12只及造模組74只。除正常組外,其余大鼠均采用DMN腹腔注射法制備大鼠肝纖維化模型,按10mg/kg劑量注射1%DMN,隔日1次,每周3次,共4周,正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。在造模期間,造模組大鼠死亡4只,用于判定模型制備情況處死4只。造模成功后,除正常組外

5、,將造模組剩余的66只大鼠再隨機(jī)分為6組,每組11只:模型對(duì)照組、扶正化瘀對(duì)照組、雄芍湯組、粗多糖組、總生物堿組、總苷組(以下分別簡(jiǎn)稱為模型組、扶正組、雄芍組、多糖組、總堿組、總苷組)。分別以0.105g/m1的扶正化瘀溶液、1.610g/ml的雄芍湯藥液、35.420mg/ml的雄芍湯粗多糖提取物溶液、0.196mg/ml的雄芍湯總生物堿提取物溶液以及25.725mg/ml的雄芍湯總苷提取物溶液,按0.5ml/100g體重給各治療組大

6、鼠灌胃,正常組與模型組灌服等量生理鹽水,每日1次,療程4周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察大鼠一般情況,藥物干預(yù)4周后處死取材。肉眼觀察大鼠新鮮肝臟;計(jì)算肝重指數(shù)和脾重指數(shù);全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肝功能指標(biāo)ALT、AST、TIBL和ALB;放射免疫分析法檢測(cè)血清肝纖維化標(biāo)志物HA、LN、PCⅣ和CIV;黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清SOD活力,DTNB還原法檢測(cè)血清GSH-PX活力,TBA法檢測(cè)血清MDA含量;ELISA法檢測(cè)血清MMP-13與TIMP-1含

7、量;樣本堿水解法檢測(cè)肝組織中羥脯氨酸含量;HE染色與Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改變;免疫組化法檢測(cè)肝組織CTGF、PDGF-B、Col-Ⅰ、α-SMA的表達(dá);FQ-PCR檢測(cè)肝組織TGF-β1mRNA表達(dá);western blotting檢測(cè)肝組織Smad3、Smad7蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.扶正化瘀膠囊、雄芍湯、雄芍湯粗多糖及雄芍湯總苷均能改善肝纖維化大鼠的一般情況,而雄芍湯總生物堿不具有此作用;

8、r>　　 2.肝重指數(shù)與脾重指數(shù):模型組肝重指數(shù)顯著低于正常組,脾重指數(shù)顯著高于正常組(P＜0.01);與模型組比較,除總堿組與模型組無(wú)顯著性差異外,其余各治療組肝重指數(shù)均顯著升高,脾重指數(shù)均顯著降低(P＜0.01);扶正組與雄芍組的肝重指數(shù)、脾重指數(shù)均無(wú)顯著性差異,與這兩組相比,各有效部位組肝重指數(shù)均顯著降低,脾重指數(shù)均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01.)。
　　 3.肝功能指標(biāo):模型組血清ALT、AST及TBIL均顯著

9、高于正常組,ALB顯著低于正常組(P＜0.01);與模型組比較,除總堿組與模型組無(wú)顯著性差異外,其余各治療組ALT、AST、TBIL均顯著降低,ALB均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);與雄芍組比較,各有效部位組ALT、AST與TIBL均顯著升高(P＜0.01)。
　　 4.肝纖維化標(biāo)志物:模型組血清HA、LN、PCⅢ及CIV均顯著高于正常組(P＜0.01);與模型組比較,除總堿組與模型組無(wú)顯著性差異外,其余各治療組HA、

10、LN、PCⅢ及CIV均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);與雄芍組比較,除多糖組和總苷組的CIV與雄芍組無(wú)顯著性差異外,多糖組、總堿組和總苷組的其余指標(biāo)均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 5.血清SOD、GSH-PX及MDA:模型組血清SOD及GSH-PX均顯著低于正常組,MDA高于正常組(P＜0.01);與模型組比較,扶正組、雄芍組和總堿組SOD及GSH-PX均顯著升高(P＜0.01),MDA均顯著降低(P＜

11、0.05或P＜0.01),多糖組、總苷組與模型組各組之間差異無(wú)顯著性;與雄芍組比較,多糖組、總苷組與總堿組的SOD、GSH-PX均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01),MDA均顯著升高(P＜0.01)。
　　 6.血清MMP-13及TIMP-1:模型組血清MMP-13顯著低于正常組,TIMP-1顯著高于正常組(P＜0.01);與模型組比較,除多糖組TIMP-1與模型組、總堿組與模型組無(wú)顯著性差異外,其余各治療組MMP-13均顯

12、著升高(P＜0.05或P＜0.01),TIMP-1均顯著降低(P＜0.01);與雄芍組比較,多糖組與總堿組MMP-13均顯著降低,TIMP-1均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 7.肝組織Hyp、肝纖維化程度:模型組Hyp、肝纖維化半定量計(jì)分均顯著高于正常組(P＜0.01);與模型組比較,除總堿組與模型組無(wú)顯著性差異外,其余各治療組Hyp、肝纖維化半定量計(jì)分均顯著降低(P＜0.01);扶正組與雄芍組無(wú)顯著性差異,各

13、有效部位組Hyp、肝纖維化半定量計(jì)分均顯著高于扶正組及雄芍組(P＜0.05或.P＜0.01,)。
　　 8.免疫組化:模型組肝組織CTGF、PDGF-B、Col-Ⅰ及α-SMA表達(dá)均顯著高于正常組(P＜0.01);與模型組比較,除總堿組與模型組無(wú)顯著性差異外,其余各治療組CTGF、PDGF-B、Col-Ⅰ及α-SMA表達(dá)均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);扶正組與雄芍組無(wú)顯著性差異,除多糖組的α-SMA表達(dá)與扶正組、雄芍組

14、各組之間差異無(wú)顯著性外,各有效部位組的其余指標(biāo)均顯著高于扶正組及雄芍組(P＜0.05或p＜0.01)。
　　 9.TGF-β1mRNA、Smad3及Smad7蛋白表達(dá):模型組肝組織TGF-β1mRNA、Smad3蛋白表達(dá)均顯著高于正常組,Smad7蛋白表達(dá)顯著低于正常組(P＜0.01);與模型組比較,除總苷組Smad7、總堿組與模型組無(wú)顯著性差異外,其余各治療組TGF-β1mRNA、Smad3蛋白表達(dá)均顯著降低,Smad7蛋白表

15、達(dá)均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);與雄芍組比較,多糖組的TGF-β1mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05),總堿組與總苷組的Smad3蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：雄芍湯總生物堿不具有抗DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的作用,而雄芍湯粗多糖與雄芍湯總苷均具有確切的改善或逆轉(zhuǎn)DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的療效.雄芍湯的物質(zhì)基礎(chǔ)為:(1)總生物堿介導(dǎo)雄芍湯抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的作用;(2)總苷介導(dǎo)雄芍湯促進(jìn)MMP-13生成

16、,抑制TIMP-1生成,從而促進(jìn)Ⅰ型膠原降解的作用,粗多糖的作用次之;(3)粗多糖介導(dǎo)雄芍湯下調(diào)TGF-β1、α-SMA及Smad3表達(dá),上調(diào)Smad7表達(dá),調(diào)節(jié)TGF-β/smad通路的作用,總苷的作用次之;(4)粗多糖與總苷共同介導(dǎo)雄芍湯抑制促纖維化細(xì)胞因子CTGF與PDGF-B表達(dá)的作用.
　　 第三部分、雄芍湯及其有效部位含藥血清對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2增殖的影響
　　 目的：觀察雄芍湯及其有效部位含藥血清對(duì)人肝星

17、狀細(xì)胞增殖的影響,探討雄芍湯抑制HSC增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法： MTT比色法檢測(cè)雄芍湯及其有效部位含藥血清對(duì)LX-2增殖的影響。
　　 結(jié)果：與20%、10%同濃度正常組相比,除總堿組與正常組無(wú)顯著性差異外,其余各治療組均對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖有抑制作用(P＜0.01);與20%同濃度雄芍組相比,總堿組、總苷組對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的抑制率顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);與10%同濃度雄芍組相比,各有效部位組對(duì)L