DIXDC1對結(jié)直腸癌發(fā)展的影響機(jī)制以及與其相關(guān)microRNA的研究.pdf

1、前言:
　　DIXDC1是新近克隆的人類Wnt通路的新基因,即ccd1基因(Coiled-coil-DIX1)人類的異構(gòu)體,ccd1基因在斑馬魚神經(jīng)管發(fā)育過程中被證實(shí)是一個Wnt通路的正調(diào)控因子。25％左右的人微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability)MSI-H的結(jié)直腸癌中檢測到Wnt通路重要組分Axin2基因突變。上述突變集中于外顯子7上的4個單核苷酸連續(xù)序列,導(dǎo)致移碼和Axin2蛋白C-末端(包括D

2、IX結(jié)構(gòu)域)的缺失,提示Axin2蛋白的C-末端可能參與抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展,然而機(jī)制不甚清楚。DIXDC1蛋白就是以Axin2的C-末端為誘餌,通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),篩選出的與Axin2C-末端存在相互作用的一個蛋白。
　　目前DIXDC1基因全長己經(jīng)成功地被克隆并制備了相應(yīng)的抗體,但關(guān)于DIXDC1生物化學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的研究報道較少。有研究顯示DIXDC1屬于actin和tubulin結(jié)合蛋白家族的新成員,提示其可能參與對細(xì)

3、胞形態(tài)和運(yùn)動的調(diào)節(jié)。
　　DIXDC1作為Wnt通路的新成員分子,其具體功能怎樣,如何通過Wnt通路對于結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行調(diào)節(jié);其本身是否受到Wnt通路的調(diào)節(jié),其調(diào)節(jié)方式如何;microRNA是否也參與調(diào)控DIXDC1的表達(dá),與其相關(guān)的miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系如何,目前未見國內(nèi)外報道。本課題從研究DIXDC1的功能為切入點(diǎn),將首次闡明其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用及機(jī)制;并進(jìn)一步探討Wnt通路對DIXDC1

4、蛋白表達(dá)水平的影響及機(jī)制;利用miRNA芯片及生物信息數(shù)據(jù)庫篩選出與DIXDC1存在相互作用的miRNA,進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)miRNA對DIXDC1表達(dá)的調(diào)控并探討相關(guān)miRNA對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響。為結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為臨床結(jié)直腸癌的診斷和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分:DIXDC1對大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究
　　目的:闡明DIXDC1對大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響并進(jìn)一步深入研究

5、其機(jī)制。
　　方法:脂質(zhì)體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法建立DIXDC1過表達(dá)的DLD1細(xì)胞;MTT法和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力;免疫組織化學(xué)方法檢測DIXDC1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及其與增殖指數(shù)(Ki-67)的相關(guān)性;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布和凋亡情況;Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平和PI3K、MAPK信號通路激活狀態(tài);雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測DIXDC1對TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性的影響;免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證DI

6、XDC1與Phospho-AKT之間的相互作用;采用PI3K信號通路抑制劑LY294002處理,觀察其對DIXDC1過表達(dá)細(xì)胞生長情況、細(xì)胞周期及周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;轉(zhuǎn)染DIXDC1siRNA干擾DIXDC1表達(dá)后,觀察其對DIXDC1過表達(dá)細(xì)胞生長情況、細(xì)胞周期及周期相關(guān)蛋白表達(dá)和PI3K信號通路的影響。
　　結(jié)果:DIXDC1的過表達(dá)于體外水平促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖,于體內(nèi)水平促進(jìn)裸鼠移植瘤形成及生長。與正常腸粘膜相比,結(jié)直

7、腸癌組織中DIXDC1蛋白表達(dá)水平升高,并且與增殖指數(shù)Ki-67的表達(dá)具有密切的相關(guān)性。DIXDC1通過上調(diào)cyclinD1、下調(diào)p21蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期G0/G1到S期的轉(zhuǎn)化,且激活PI3K信號通路。同時DIXDC1可以上調(diào)β-catenin蛋白表達(dá),并且具有增強(qiáng)TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性的作用。通過PI3K信號通路抑制劑作用或者干擾DIXDC1蛋白的表達(dá)后,β-catenin和cyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)而p21蛋白表達(dá)升高,同時

8、阻滯了細(xì)胞周期G0/G1到S期的轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論:DIXDC1具有促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成的作用,其過表達(dá)后可以通過上調(diào)cyclinD1和下調(diào)p21蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期G0/G1到S期的轉(zhuǎn)化,DIXDC1促大腸癌細(xì)胞增殖效應(yīng)可能與PI3K信號通路的激活相關(guān)。
　　第二部分:Wnt通路對DIXDC1的調(diào)控及其機(jī)制研究
　　目的:闡明Wnt通路對DIXDC1蛋白表達(dá)的調(diào)控及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:免疫組織化學(xué)

9、方法檢測DIXDC1與β-catenin在結(jié)直腸癌中共表達(dá)及共定位情況;Real-timeRT-PCR檢測正常腸粘膜、結(jié)直腸癌組織及Wnt-3a刺激前后大腸癌細(xì)胞中DIXDC1mRNA表達(dá)水平的改變;Western blot檢測Wnt-3a刺激后大腸癌細(xì)胞中DIXDC1蛋白表達(dá)水平的改變;CHXchaseassay檢測DIXDC1蛋白的半衰期,并觀察Wnt-3a對DIXDC1蛋白穩(wěn)定性的影響;采用MG132處理細(xì)胞后應(yīng)用Weaern b

10、lot檢測DIXDC1蛋白表達(dá)的改變;免疫沉淀技術(shù)檢測DIXDC1與泛素蛋白的結(jié)合情況,并觀察Wnt-3a對DIXDC1蛋白泛素化水平的影響:免疫共沉淀技術(shù)檢測Wnt-3a對DIXDC1蛋白磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果:結(jié)直腸癌組織中DIXDC1與β-catenin存在共表達(dá)及共定位情況。與正常組織相比,結(jié)直腸癌組織中DIXDC1蛋白表達(dá)水平升高但mRNA表達(dá)水平卻下降。體外實(shí)驗(yàn)中Wnt-3a可以誘導(dǎo)DIXDC1蛋白表達(dá)水平的升高

11、,但mRNA表達(dá)水平卻未見升高。Wnt-3a增加DIXDC1蛋白的穩(wěn)定性,蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后,DIXDC1蛋白表達(dá)水平升高。Wnt-3a抑制了DIXDC1與泛素蛋白的結(jié)合從而增加了DIXDC1蛋白穩(wěn)定性,同時抑制了DIXDC1蛋白磷酸化水平。
　　結(jié)論:DIXDC1蛋白是通過蛋白酶體途徑降解的,經(jīng)典Wnt通路的激活可以通過抑制其泛素化而增加DIXDC1蛋白的穩(wěn)定性;Wnt通路可能通過抑制DIXDC1蛋白的磷酸化水平

12、而影響其泛素化降解。
　　第三部分:與DIXDC1存在相互作用microRNA的篩選及其對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展影響的研究
　　目的:篩選并驗(yàn)證與DIXDC1存在相互作用的miRNA,并闡明其對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響。
　　方法:首先通過一系列重復(fù)實(shí)驗(yàn)對Agilent公司microRNA芯片的穩(wěn)定性和可靠性進(jìn)行評估;芯片篩選正常腸粘膜、炎性息肉、腸腺瘤和結(jié)直腸癌中差異表達(dá)的miRNA;選取芯片檢測結(jié)果中差異表達(dá)的17個miR

13、NA,對14對樣本RNA進(jìn)行Real-time RT-PCR檢測;運(yùn)用Significance Analysis of Microarray(SAM)芯片數(shù)據(jù)分析技術(shù)對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展各階段中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析;通過Target Scan 4.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測,篩選與DIXDC1存在較為保守的相互作用,且芯片結(jié)果中變化較為顯著的miRNA;通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miRNA與DIXDC13’UTR區(qū)域的結(jié)合情況;miRNA寡核苷

14、酸轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)miRNA對DIXDC1蛋白表達(dá)水平的影響。通過Corrected t test:Bonferroni correction統(tǒng)計分析進(jìn)一步探討與DIXDC1相關(guān)miRNA對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響。
　　結(jié)果:Agilent公司的microRNA芯片(chip)含有8個獨(dú)立的陣列(array),陣列內(nèi)重復(fù)檢測探針的平均變異系數(shù)僅為6.3％,同一芯片內(nèi)陣列之間的相關(guān)性到達(dá)0.999,不同芯片

15、之間的相關(guān)性也到達(dá)0.999,Real-timeRT-PCR檢測的17個miRNA的差異變化與芯片檢測結(jié)果的相關(guān)性到達(dá)0.90。經(jīng)過SAM分析顯示,在正常腸粘膜-炎性息肉與腸腺瘤-結(jié)直腸癌中表達(dá)存在明顯差異的有63個miRNA,其中40個表達(dá)升高,23個表達(dá)下降;在腸腺瘤與結(jié)直腸癌中表達(dá)存在明顯差異的有38個miRNA,其中11個表達(dá)升高,27個表達(dá)下降。選擇下調(diào)表達(dá)最明顯的miR-195和miR-497進(jìn)行深入研究,發(fā)現(xiàn)miR-195

16、和miR-497均能作用于DIXDC13’UTR,進(jìn)而抑制DIXDC1mRNA的轉(zhuǎn)錄,且均可以抑制DIXDC1蛋白的表達(dá)。通過Corrected t test:Bonferroni correction統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)一部分miRNA只在從正常腸粘膜-炎性息肉到腸腺瘤病變過程中存在差異表達(dá);另外一部分miRNA卻只在從腸腺瘤到結(jié)直腸癌(Dukes’A/B)的病變過程中存在差異表達(dá);而還有一部分miRNA在腸癌發(fā)生發(fā)展的整個過程中均存在差異表

17、達(dá),即從正常腸粘膜-炎性息肉到腸腺瘤到結(jié)直腸癌(Dukes’A/B),miR-195和miR-497在腸癌發(fā)生發(fā)展的整個過程中均存在差異表達(dá),參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展的整個過程。
　　結(jié)論:在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中存在一系列差異表達(dá)的microRNA。miR-195和miR-497在腸腺瘤和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)均顯著下調(diào),且與DIXDC1存在相互作用,參與DIXDC1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié),我們認(rèn)為DIXDC1、miR-195和miR-4