玉米肽的制備條件及其醒酒護(hù)肝機(jī)理研究.pdf

1、為了利用植物蛋白資源,使?jié)穹ㄉa(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物--玉米黃粉增值,本文采用正交試驗研究了從黃粉中提取玉米蛋白及用中性蛋白酶(Nutrase)、堿性蛋白酶(Alcalase)酶解玉米蛋白,制備玉米醒酒肽的條件；進(jìn)一步采用超濾、配位色譜法、RP-HPLC、氨基酸分析儀等手段對玉米肽進(jìn)行了分離及成分分析。通過體外抗羥基自由基試驗、激活乙醇脫氫酶(ADH)活性試驗及動物試驗考察醒酒肽對小鼠血清中乙醇濃度的影響,結(jié)合玉米肽對D-氨基半乳糖(D-Gal

2、)及乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型鼠的保護(hù)作用研究,初步探討了玉米肽的醒酒保肝作用機(jī)制；比較了玉米肽和玉米蛋白的功能性質(zhì),對玉米肽進(jìn)行了脫苦研究,并用體外激活A(yù)DH活性試驗比較了幾種脫苦方法對玉米肽醒酒活性的影響。結(jié)果如下:
　　 1.提取正交試驗表明:以粗蛋白含量為56.97％玉米黃粉為原料,優(yōu)化提取玉米蛋白條件,其最佳條件為:提取液(由0.1mol/LNaOH與95％乙醇配制)堿醇比為45/55(v/v),料液比1:15,提取時間2

3、h,溫度55℃；在最佳提取條件下,提取物中粗蛋白含量提高到93.14％。
　　 2.玉米肽醒酒作用機(jī)理研究
　　 (1)酶解正交試驗表明:用中性蛋白酶酶解玉米蛋白,當(dāng)料液比為1:25,酶底比為1.5％,酶解時間為2h時,酶解所得玉米肽對ADH的激活率最高為35.75％,對·OH的抑制率為61.54％,肽回收率為20.31％;用堿性蛋白酶酶解玉米蛋白,當(dāng)料液比為1:25,酶底比為0.5％,酶解時間為4h時,酶解所得玉米肽對

4、ADH的激活率為最高為27.26％,對·OH的抑制率為59.58％,肽回收率可達(dá)82.06％。前者雖有較高的ADH激活率,但其肽回收率過低。
　　 (2)動物試驗表明:灌胃中性蛋白酶低水解度肽(2h、酶底比0.5％、料液比1:25)能使小鼠血醇濃度降低54.06％(極顯著降低,p<0.001),但該肽的回收率過低(19.97％)；灌胃堿性蛋白酶中水解度肽(4h、酶底比0.5％、料液比1:20)的醒酒活性高,并存在劑量效應(yīng)關(guān)系,當(dāng)

5、灌胃劑量為800 mg/kg·bw時,小鼠血醇濃度降低了62.80％(極顯著降低,p<0.001),且該粗肽的回收率高(82.01％);堿性蛋白酶的中水解度肽具有開發(fā)價值。
　　 (3)動物試驗與體外試驗結(jié)果基本吻合,即中性蛋白酶低水解度肽和堿性蛋白酶中水解度肽醒酒效果好,說明并非水解度越高,醒酒活性越好；同時也說明用體外激活A(yù)DH活性試驗和抑制·OH試驗,篩選高醒酒活性玉米肽是便捷可行的方法。
　　 (4)以對ADH的

6、激活率和對·OH抑制率為活性跟蹤指標(biāo),將堿性蛋白酶酶解玉米粗肽(crude corn peptides,CCP)過分子量為6000u的超濾膜,得到高活性玉米肽(com peptides,CP),CP對·OH抑制率高于CCP,前者為76.96％,后者為50.50％；而CCP對ADH的激活率高于CP,前者為30.69％,后者為26.18％;采用Cu2+-SephadexG-25配位色譜法分離CP,得CPⅠ、CPⅡ和CAA。三者中以CPⅡ?qū)Α?/p>

7、OH抑制率及對ADH的激活率最高,分別為61.91％和28.85％。
　　 (5)氨基酸分析結(jié)果顯示:玉米肽中丙氨酸、亮氨酸含量高,尤其是亮氨酸含量；CP、CPⅠ、CPⅡ具有高F值。
　　 (6)本文實驗結(jié)果提示:玉米肽的醒酒作用機(jī)制之一是通過激活胃ADH,加強(qiáng)乙醇在胃腸道的首過代謝,有胃腸吸收抑制劑的作用:其醒酒作用機(jī)制之二是通過激活肝臟ADH,增強(qiáng)乙醇的代謝,即有代謝增強(qiáng)劑的作用；其醒酒作用機(jī)制之三是可通過提高丙氨酸

8、、亮氨酸的濃度,產(chǎn)生穩(wěn)定的輔酶(NAD+),抑制血液中乙醇濃度的升高。
　　 3.堿性蛋白酶酶解CCP對小鼠化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用
　　 (1)CCP對D-Gal引起的小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用,且呈劑量--效應(yīng)關(guān)系。與D-Gal肝損傷模型組小鼠比較,當(dāng)CCP灌胃劑量為800mg/kg·bw時,能極顯著(p<0.01)降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和甘油三酯(TG)含量,同時也能極顯著(p<0

9、.01)地抑制還原型谷胱甘肽(GSH)含量的下降;病理學(xué)觀察也顯示出明顯的劑量--效應(yīng)關(guān)系,高劑量給肽組小鼠肝細(xì)胞病變明顯好轉(zhuǎn)或恢復(fù)。
　　 (2)CCP對乙醇引起的小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用,生化指標(biāo)呈劑量--效應(yīng)關(guān)系。與小鼠乙醇肝損傷模型組比較,灌胃CCP200mg/kg·bw、400mg/kg·bw、800mg/kg·bw時,均能極顯著地抑制小鼠血清中GSH含量的下降；灌胃CCP800mg/kg·bw時,可極顯著降低TG的含

10、量、顯著抑制MDA的產(chǎn)生；肝組織病理學(xué)觀察顯示,高劑量給肽組小鼠肝細(xì)胞與正常組小鼠肝細(xì)胞基本相同；但從組織形態(tài)學(xué)來說,該模型組鼠肝損傷程度及脂肪變性程度均不及D-Gal模型組明顯,這與乙醇的毒性不及D-Gal有關(guān)。
　　 (3)本文實驗結(jié)果提示:玉米肽的保肝機(jī)制之一是其具有良好的抑制自由基的能力;保肝機(jī)制之二是其能激活A(yù)DH的酶活,增強(qiáng)乙醇的胃腸首過代謝:從而減輕自由基、高濃度乙醇對肝臟造成的損傷；保肝機(jī)制之三是具有高F值,可以

11、糾正急性肝損傷模型鼠血漿及腦中的氨基酸病態(tài)模式。
　　 4.堿性蛋白酶酶解CCP的應(yīng)用研究
　　 (1)和玉米蛋白相比,玉米肽的溶解度大大提高,尤其是在等電點,在不同pH值下溶解度均在90％以上；起泡性和乳化性都得到很大程度的提高；黏度降低,流動性好。
　　 (2)分別利用活性炭、風(fēng)味酶和β-環(huán)狀糊精三種方法對玉米肽進(jìn)行脫苦,并考察了脫苦對醒酒活性的影響,三種脫苦方法各有利弊,應(yīng)用于具體的食品中時要綜合考慮。