源于條斑紫菜的抗菌肽制備、固相合成及其作用機(jī)理研究.pdf

1、本文以條斑紫菜(Porphyrayezoensis)為原料，提取不同溶解性蛋白質(zhì)后進(jìn)行酶解并對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有顯著抗菌作用的酶解物備后續(xù)使用。
　　將上述獲得的酶解物應(yīng)用超濾、Sephadex C-25離子交換層析、Sephadex G-25分子篩層析、毛細(xì)管高效液相色譜以及質(zhì)譜分析進(jìn)行分離純化、測序，在此基礎(chǔ)上固相合成抗菌肽，并對該抗菌肽的主要理化性質(zhì)以及抗

2、菌機(jī)理進(jìn)行研究。
　　研究結(jié)論如下：
　　1.條斑紫菜蛋白質(zhì)提取及酶解條件優(yōu)化
　　將提取的水溶性、酸溶性、鹽溶性和堿溶性蛋白質(zhì)分別用6種酶進(jìn)行酶解，將所得24種酶解物采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、四聯(lián)微球菌（Micrococcus tetragenus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）以及大腸桿菌（Escherichia coli）四種細(xì)菌進(jìn)行抗

3、菌活性測定。其中，水溶性蛋白質(zhì)在硫酸銨飽和度為40-50％時(shí)沉淀所得蛋白質(zhì)的胃蛋白酶酶解物中分子量小于5 KD的級分，對金黃色葡萄球菌抗菌效果最為明顯。最優(yōu)酶解條件為溫度40℃、加酶量2％、pH1.5、時(shí)間2h。
　　2.條斑紫菜抗菌肽的純化、測序及固相合成
　　經(jīng)超濾、層析純化得到的組份進(jìn)行混合質(zhì)譜鑒定，從中篩選出具有最佳抗菌活性的多肽序列TPDSEAL，分子量為732Da，等電點(diǎn)為pH5.34。通過APD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析和

4、比對，發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的5種抗菌肽AP01211、AP01344、AP02431、AP01212、AP01210相似度均在45%以下。采用固相合成法，該抗菌肽已經(jīng)成功合成。
　　3.條斑紫菜抗菌肽的理化性質(zhì)及作用機(jī)理研究
　　理化性質(zhì)：
　　1.對介質(zhì)pH及溫度變化、紫外線處理都較為穩(wěn)定。
　　2.吸水性強(qiáng)，宜干燥保存；吸油率較好，可添加到香腸等肉類制品以及油餅等高油食品中，使產(chǎn)品組織細(xì)膩口感好，同時(shí)起到防腐保

5、鮮作用。
　　作用機(jī)理：
　?、倏咕娘@著抑制金黃色葡萄球菌生長，致使其生長不能出現(xiàn)正常的對數(shù)生長期。
　?、陔S著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)液中堿性磷酸酶的含量、蛋白質(zhì)含量、β-半乳糖苷酶的含量和電導(dǎo)率值逐漸增加，推測可能由于抗菌肽作用致使細(xì)胞破損，細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)嚴(yán)重外流。
　?、蹝呙桦婄R下，金黃色葡萄球菌的菌體最初是光滑、均勻、飽滿的；經(jīng)抗菌肽處理后的菌體表面模糊、菌體不規(guī)則；隨時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間延長，