降血糖藥物普蘭林肽的固相合成.pdf

1、世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,全球糖尿病患者已超過3.6億人,我國(guó)糖尿病患者人數(shù)居世界第一,現(xiàn)有降糖藥物種類較多,降糖機(jī)制不盡相同,但是仍不能滿足臨床用藥的需要。2005年3月,FDA批準(zhǔn)普蘭林肽(Pramlintide)注射劑用于成人1型和2型糖尿病,并取得良好的臨床效果。普蘭林肽是1型和2型糖尿病的輔助[1]治療藥物,主要用于單用某種降糖藥物不起作用的糖尿病患者,它輔助降糖藥物形成一種人體內(nèi)環(huán)境,使其發(fā)揮降糖作用。此外,有研究報(bào)道,普蘭

2、林肽還具有調(diào)節(jié)食欲[2]的作用,美國(guó)Amylin制藥公司正在利用普蘭林肽開發(fā)減肥藥。國(guó)內(nèi)報(bào)道,黃亞東等人采用基因方法[3]合成了一種改構(gòu)的人淀粉樣多肽突變體-普蘭林肽;近年來,國(guó)內(nèi)外有關(guān)普蘭林肽固相合成研究較多,主要集中在片段合成[4]?？傮w看來,降糖藥物普蘭林肽注射劑給特殊糖尿病患者帶來了福音,但進(jìn)口普蘭林肽價(jià)格昂貴,且難以滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求,隨著普蘭林肽在糖尿病中治療地位日趨重要,開發(fā)國(guó)產(chǎn)普蘭林肽原料藥的合成工藝研究具有重要的意義。

3、
　　普蘭林肽含37個(gè)氨基酸以及一對(duì)二硫鍵[5]。藥理研究表明,普蘭林肽的1-22個(gè)氨基酸及分子內(nèi)二硫鍵,末端酰胺是其重要的分子生物學(xué)功能位點(diǎn)[6],也是合成過程中需要關(guān)鍵注意的氨基酸位點(diǎn)。本研究采用Fmoc固相多肽合成法,采用逐步縮合的策略,以RinkAmide-AM樹脂做載體,HBTU-HOBt-DIEA做縮合劑,得到全保護(hù)線性普蘭林肽樹脂,以TFA-苯甲硫醚-苯酚-H2O-EDT-TIS配比的裂解液配方脫除保護(hù)基團(tuán),分別采用

4、空氣,DMSO,雙氧水氧化分子內(nèi)兩個(gè)半胱氨酸的巰基形成一對(duì)二硫鍵,制備型RP-HPLC分離純化,氧化前后的普蘭林肽經(jīng)RP-HPLC、ESI-MS、MALDI-TOF-MS和氨基酸組分分析確證,合成了37個(gè)氨基酸以及一對(duì)二硫鍵的普蘭林肽。
　　目前,研究普蘭林肽的固相合成方法,制備普蘭林肽原料藥是國(guó)內(nèi)多肽藥物開發(fā)的難點(diǎn)之一。探索普蘭林肽的新合成方法,降低合成成本,這將為大規(guī)模生產(chǎn)工藝的實(shí)現(xiàn)提供有力的基礎(chǔ),并為建立多肽固相合成技術(shù)平臺(tái)

5、提供一定的理論支持。
　　目的:
　　本研究確立了普蘭林肽合成過程以及目標(biāo)產(chǎn)物的檢測(cè)方法,達(dá)到了分析鑒定的要求;本研究探索(優(yōu)化)普蘭林肽的固相合成過程中合成方法、裂解方法、氧化方法及純化方法,通過合成過程中條件的優(yōu)化,降低合成普蘭林肽的成本,為工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。
　　方法:
　　1.固相多肽合成中檢測(cè)方法:
　　采用Fmoc吸光度法定量檢測(cè)氨基酸末端裸露的氨基,定量計(jì)算氨基酸的連接效率;茚三酮顏色反應(yīng)定

6、性檢測(cè)氨基酸的連接程度;合成過程使用RP-HPLC和ESI-MS定性觀察合成片段的正確與否。
　　2.普蘭林肽的固相合成:
　　利用標(biāo)準(zhǔn)品Fmoc-Gly-Wang-Resin確定實(shí)驗(yàn)室替代度系數(shù)的校正值;通過選擇縮合劑體系,控制投料摩爾比和反應(yīng)時(shí)間,掌握RinkAmide-AM-Resin的替代度;接肽過程,手工多肽反應(yīng)柱和多肽合成儀平行進(jìn)行,探索了縮合反應(yīng)中樹脂替代度、投料摩爾比、反應(yīng)時(shí)間對(duì)普蘭林肽固相合成的影響。

7、>　　通過計(jì)算粗品普蘭林肽得率和純度,優(yōu)化普蘭林肽樹脂裂解液配方;三種氧化方法使粗品普蘭林肽分子內(nèi)二個(gè)巰基氧化成環(huán);摸索出適當(dāng)?shù)闹苽湫蚏P-HPLC條件,制備純化普蘭林肽。
　　純化后普蘭林肽經(jīng)RP-HPLC、ESI-MS、MALDI-TOF-MS和氨基酸組分分析確證。
　　結(jié)果:
　　1.Fmoc吸光度法確定實(shí)驗(yàn)室替代度系數(shù)校正值為6L·(mmol·cm)-1,Fmoc-Tyr(tBu)-RinkAmide-Am-R

8、esin替代度為0.25mmol·g-1時(shí)最終合成粗品普蘭林肽純度較高。
　　2.縮合劑體系HBTU-HOBt-DIEA成本低,縮合能力強(qiáng),副反應(yīng)少,能滿足普蘭林肽固相合成的要求;摩爾投料比為1:5,反應(yīng)時(shí)間150min確定為最優(yōu)固相合成條件;TFA-苯甲硫醚-苯酚-H2O-EDT-TIS配比的裂解液脫除保護(hù)基團(tuán),粗品得率高,純度大;空氣,DMSO,雙氧水三種方法氧化兩個(gè)半胱氨酸的巰基形成一對(duì)二硫鍵的比較,雙氧水氧化法為最優(yōu);制備

9、型RP-HPLC純化粗品普蘭林肽取得理想結(jié)果。
　　3.合成含37個(gè)氨基酸以及一對(duì)二硫鍵的普蘭林肽經(jīng)RP-HPLC、ESI-MS、MALDI-TOF-MS、氨基酸組分分析確證,合成正確,粗品純度在50.0％以上,粗品經(jīng)制備型RP-HPLC色譜純化,所得精品普蘭林肽的純度大于95.0%。
　　結(jié)論:
　　1.使用手工多肽合成柱和多肽合成儀,采用固相合成方法逐步縮合策略均可以合成全保護(hù)線性普蘭林肽樹脂。
　　2.合適

10、的裂解液配方可以使全保護(hù)線性普蘭林肽與樹脂分離,并完全脫除普蘭林肽氨基酸的保護(hù)基團(tuán)。
　　3.常用簡(jiǎn)單氧化方法可以使線性普蘭林肽分子內(nèi)成環(huán),雙氧水氧化法簡(jiǎn)單方便,中間過程無需過濾純化,無損失。
　　4.制備型反相高效液相分離純化粗品普蘭林肽,得率在50%左右,精品普蘭林肽純度大于95.0%。
　　5.合成多肽經(jīng)RP-HPLC保留時(shí)間定位,ESI-MS和MALDI-TOF-MS分子離子峰確證,氨基酸組分分析進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)