在不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥機(jī)制中外排泵及外膜蛋白表達(dá)作用的研究.pdf

1、[目的]探索在體外碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物選擇性壓力作用下導(dǎo)致的耐藥突變菌株中,主動(dòng)外排泵系統(tǒng)及外膜蛋白表達(dá)對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥所起的作用。
　　 [方法]從SEANIR監(jiān)測(cè)瓊脂稀釋法藥敏數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇碳青霉烯類(lèi)敏感的不動(dòng)桿菌,用ARDRA技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行分子水平上的鑒定。將入選的親代敏感菌株在體外亞胺培南、美羅培南碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物選擇性壓力作用下,篩選出碳青霉烯類(lèi)耐藥突變菌株,并用ARDRA對(duì)其進(jìn)行鑒定。通過(guò)RAPD、PFGE、Diver

2、silab和MLST4種分型方法對(duì)親代敏感菌株和耐藥突變株進(jìn)行同源性分析。選擇遺傳背景密切相關(guān)而碳青霉烯類(lèi)耐藥表型不同的親代敏感菌株和其耐藥突變菌株,用瓊脂稀釋法對(duì)其進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)；另外,與藥物敏感性實(shí)驗(yàn)同步進(jìn)行,在抗菌藥物中加入外排泵抑制劑氰氯苯腙(CCCP),觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株MIC的影響,初步探索耐藥突變菌株是否存在主動(dòng)外排泵系統(tǒng)；用普通PCR和基因測(cè)序的方法對(duì)常見(jiàn)碳青霉烯酶及其插入序列、整合子、外排泵及其調(diào)節(jié)基因、外膜蛋白ca

3、rO基因進(jìn)行分析；用SDS-PAGE電泳檢測(cè)不動(dòng)桿菌外膜蛋白表達(dá)情況；并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不動(dòng)桿菌主要外排泵系統(tǒng)AdeABC及其調(diào)節(jié)基因和carO基因的表達(dá)水平。
　　 [結(jié)果]本研究入選的6株碳青霉烯類(lèi)敏感的不動(dòng)桿菌,ARDRA鑒定為4株2型鮑曼不動(dòng)桿菌、1株基因組3型不動(dòng)桿菌和1株13TU型不動(dòng)桿菌,各菌株的亞胺培南和美羅培南耐藥突變菌株ARDRA結(jié)果與親代菌株一致。從亞胺培南和美羅培南體外篩選耐藥菌株的過(guò)程可以得出:

4、美羅培南更容易誘導(dǎo)出耐藥菌株,但其誘導(dǎo)的美羅培南耐藥菌株大多對(duì)亞胺培南敏感,而亞胺培南誘導(dǎo)的耐藥菌株,對(duì)美羅培南表現(xiàn)為高耐的現(xiàn)象。PFGE、RAPD、Diversilab和MLST4種分型方法的結(jié)果顯示:每株菌的親代敏感菌株和其體外選擇耐藥突變株同源性密切相關(guān)；RAPD和Diversilab的分辨力比PFGE差,不能區(qū)分親緣關(guān)系相近的菌株,pu61親代敏感菌株及其耐藥突變菌株與pu53親代敏感菌株及其耐藥突變菌株RAPD和Diversi

5、labDNA顯示密切相關(guān),但PFGE顯示兩株菌間相差7個(gè)條帶以上,無(wú)親緣關(guān)系；MLST雖然基因組3型不動(dòng)桿菌gdhB和gpi PCR擴(kuò)增或測(cè)序失敗,但與其他分型方法相比,表現(xiàn)為遺傳背景一致的菌株具有相同的ST型。rpoD非簡(jiǎn)并引物對(duì)基因組3型不動(dòng)桿菌和基因組13TU型不動(dòng)桿菌擴(kuò)增效果不好。體外篩選的碳青霉烯類(lèi)耐藥不動(dòng)桿菌呈現(xiàn)多重耐藥表型,僅對(duì)粘菌素、米諾環(huán)素表現(xiàn)為很好的抗菌活性,耐藥率≤2％,碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的抗菌活性亞胺培南>美羅培

6、南。亞胺培南和美羅培南E-test法和瓊脂稀釋法藥敏結(jié)果相差在2個(gè)稀釋濃度范圍內(nèi),但最終判定的藥敏表型一致。CCCP可以降低抗菌藥物的MIC,加入CCCP后各抗菌藥物的耐藥率均有不同程度的下降,外排泵表型陽(yáng)性菌株分布中耐藥菌株所占構(gòu)成比率最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CCCP對(duì)抗菌藥物敏感性的影響,結(jié)果顯示美羅培南、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟和哌拉西林-他唑巴坦加入和不加入CCCP兩組藥物敏感性表型構(gòu)成比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,p值均<0.01。

7、22株親代敏感菌株和耐藥突變菌株,除鮑曼不動(dòng)桿菌表達(dá)OXA-51外,均不表達(dá)碳青霉烯酶和插入序列,少數(shù)幾株菌表達(dá)ESBLs和存在Ⅰ類(lèi)整合子,但整合子只攜帶了對(duì)氨基糖甙類(lèi)、磺胺和消毒劑耐藥的基因。AdeABC外排泵系統(tǒng)完整性及adeR、adeS、和adeB內(nèi)部保守序列的序列分析顯示各菌株的親代敏感菌株和其耐藥突變菌株具有相同的特點(diǎn)?；蚪M13TU型不動(dòng)桿菌表達(dá)adeB泵基因。22株細(xì)菌AbeMN外排泵系統(tǒng)均陽(yáng)性,AdeDE外排泵系統(tǒng)均陰性

8、,包括基因組3型不動(dòng)桿菌?；蚪M3型不動(dòng)桿菌缺失carO基因,其他菌株carO基因全長(zhǎng)序列分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)插入序列。SDS-PAGE電泳顯示zj69亞胺培南和美羅培南篩選的耐藥突變菌株與其敏感菌株相比外膜蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別,另外5株不動(dòng)桿菌美羅培南中介或耐藥菌株與其各自敏感菌株相比,均表現(xiàn)為31.6kDOMP表達(dá)減弱或缺失。硅膠柱DNaseⅠ消化提取的RNA無(wú)基因組DNA的污染,且質(zhì)量和濃度均滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。內(nèi)參基因16S rRNA及各目的基

9、因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)均滿(mǎn)足相關(guān)系數(shù)r的絕對(duì)值>0.98,斜率在-3.0～-3.5之間。擴(kuò)增曲線(xiàn)呈標(biāo)準(zhǔn)的S形曲線(xiàn),融解曲線(xiàn)分析各個(gè)基因均呈現(xiàn)特征性的峰圖,無(wú)非特異產(chǎn)物或引物二聚體。熒光定量PCR雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法相對(duì)定量分析顯示,相對(duì)于16srRNA內(nèi)參基因,除個(gè)別碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株外,外排泵系統(tǒng)adeB、adeR和adeS基因的表達(dá)量均有不同程度的上升,而carO基因的表達(dá)量有不同程度的下降。
　　 [結(jié)論]亞胺培南和美羅培南兩種碳青霉烯類(lèi)藥

10、物體外誘導(dǎo)不動(dòng)桿菌耐藥的能力不同,可能兩者在體外誘導(dǎo)不動(dòng)桿菌耐藥方面存在不同的機(jī)制,或具有相同的耐藥機(jī)制,但對(duì)介導(dǎo)兩種碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥的特異性程度不同。普通PCR和基因測(cè)序?qū)ΤＲ?jiàn)的耐藥決定因子進(jìn)行分析,排除了由碳青霉烯酶、外排泵基因突變和carO基因插入失活等耐藥機(jī)制。外排泵抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示美羅培南組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示可能外排泵對(duì)美羅培南的特異性程度高；熒光定量PCR顯示亞胺培南和美羅培南耐藥突變菌株外排泵系統(tǒng)表達(dá)量上升,外膜蛋白