雌激素對(duì)絕經(jīng)前后女性腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa作用的研究.pdf

1、目的：原發(fā)性高血壓病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病之一,主要表現(xiàn)為小動(dòng)脈和微動(dòng)脈張力的增加,血管壁不能對(duì)抗血管緊張度增高以及對(duì)血管活性物質(zhì)的反應(yīng)性出現(xiàn)異常,臨床表現(xiàn)為血壓的持續(xù)增高;人體腸系膜血管是人體主要的內(nèi)臟血管,在動(dòng)脈中占有較大比例,而且是形成外周阻力的主要?jiǎng)用},對(duì)血管活性物質(zhì)敏感,對(duì)人體血壓的調(diào)節(jié)具有舉足輕重的作用;大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium cha

2、nnels,BKCa)是動(dòng)脈平滑肌上主要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)器,在血管的舒縮調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。雌激素(estrogen, E)是女性體內(nèi)重要的激素之一,具有很多的生物學(xué)效應(yīng)。流行病學(xué)調(diào)查顯示,原發(fā)性高血壓病具有明顯的性別差異,絕經(jīng)前婦女原發(fā)性高血壓的發(fā)病率明顯低于同齡的男性發(fā)病率,但在女性絕經(jīng)后則不存在這樣的差異。研究顯示,雌激素在女性心血管功能正常的維持和調(diào)節(jié)方面具有重要的意義,其機(jī)制有可能與通過(guò)雌激素受體(Estrogen Recept

3、or, ER)調(diào)節(jié)其動(dòng)脈平滑肌的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān),但具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),通過(guò)觀察絕經(jīng)前后女性腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)BKCa宏觀電流及自發(fā)性瞬時(shí)外向電流(spontaneous transient outward currents, STOCs),并研究E對(duì)絕經(jīng)前女性非高血壓(pre-menopause women non-hypert

4、ension,PNH)組、絕經(jīng)后女性非高血壓(post-menopause women non-hypertension, NH)組及絕經(jīng)后女性原發(fā)性高血壓(post-menopause women essential hypertension, EH)組腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上BKCa及STOCs敏感性變化,探討E、BKCa與女性原發(fā)性高血壓病之間的關(guān)系,為E對(duì)女性心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：在體式顯微鏡下,游離出腸系膜動(dòng)脈

5、,并縱向剖開剪成2 mm×2 mm×1 mm的動(dòng)脈條塊,放在酶液中進(jìn)行兩步酶消化。選取表面光滑、折光性好、立體感強(qiáng)的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄通道電流。記錄到的電流信號(hào)經(jīng)過(guò)膜片鉗放大器放大,經(jīng)過(guò) AD/DA轉(zhuǎn)換器處理后輸入計(jì)算機(jī),采用Clampfit10.1、MiniAnalysis6.0、OriginPro8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理統(tǒng)計(jì)。比較絕經(jīng)前PNH組、絕經(jīng)后NH組和EH組應(yīng)用E前后BKCa宏觀電流及STOC

6、s的變化。結(jié)果：(1)采用兩步急性酶法分離的女性腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 BKCa宏觀電流和STOCs的基本特性:①BKCa宏觀電流具有明顯的電壓依賴性和外向整流特性;STOCs的幅度和頻率具有顯著的電壓依賴性,并隨機(jī)疊加在BKCa宏觀電流上。②200 nM的BKCa特異性阻斷劑Iberiotoxin(IbTX)可明顯抑制宏觀外向電流以及阻斷STOCs。(2)絕經(jīng)前女性PNH組BKCa宏觀電流及STOCs對(duì)雌激素反應(yīng)性變化:雌激素可顯著激活

7、PNH組上BKCa宏觀電流和STOCs。在測(cè)試電壓0mV到+60mV范圍,100μM E可顯著性激活BKCa宏觀電流,在0 mV和+60 mV時(shí)其電流密度分別從1.98±0.39 pA/pF、16.43±4.90 pA/pF增加到4.45±1.25 pA/pF(P<0.05,n=7)、32.36±6.86 pA/pF(P<0.01,n=7);電位為-20mV時(shí),STOCs的幅度和頻率分別從8.98±2.56 pA、3.05±0.84 H

8、z增加到16.88±3.90 pA(P<0.05,n=7)、5.26±1.46 Hz(P<0.01,n=7)。(3)絕經(jīng)后女性NH組BKCa宏觀電流及STOCs對(duì)雌激素反應(yīng)性變化:雌激素可顯著激活NH組上BKCa宏觀電流和STOCs。在測(cè)試電壓0mV到+60mV范圍,100μM E可顯著性激活BKCa宏觀電流,在0mV和+60 mV時(shí)其電流密度分別從1.99±0.41 pA/pF、15.89±4.87 pA/pF增加到3.26±1.32

9、 pA/pF(P<0.05,n=23)、27.88±6.75 pA/pF(P<0.01,n=23);電位為-20mV時(shí),加入100μM E后,STOCs的幅度和頻率分別從8.56±2.43 pA、2.98±0.77 Hz增加到14.75±3.78 pA(P<0.05,n=23)、4.70±1.57Hz(P<0.01,n=23)。(4)絕經(jīng)后女性EH組BKCa宏觀電流及STOCs對(duì)雌激素的反應(yīng)性變化:EH組在測(cè)試電壓-60mV到+50 m

10、V范圍,100μM E對(duì)BKCa宏觀電流沒有顯著性激活作用,僅僅在+60mV時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在0mV和+60mV時(shí)其電流密度分別從1.35±0.44 pA/pF、4.48±1.47 pA/pF增加到1.48±0.55 pA/pF(P>0.05,n=17)、7.17±2.47 pA/pF(P<0.05,n=17);在電位為-20mV時(shí),加入100μM E后,STOCs的幅度和頻率分別從5.67±1.73 pA、1.28±0.43 Hz增加

11、到6.58±1.34 pA(P>0.05,n=17)、1.90±0.99 Hz(P<0.05,n=17)。(5)PNH組、NH組和EH組對(duì)雌激素反應(yīng)性變化的比較:①在+60 mV時(shí),絕經(jīng)前PNH組加入100μM E后,BKCa電流密度增加了0.97±0.40倍,電位為-20mV時(shí),STOCs的幅度和頻率分別增加了0.88±0.43倍和0.72±0.39倍。②絕經(jīng)后NH組加入100μM E后,BKCa電流密度增加了0.75±0.47倍,電

12、位為-20mV時(shí),STOCs的幅度和頻率分別增加了0.72±0.32倍和0.58±0.34倍。③在+60 mV時(shí),EH組加入100μM E后,BKCa的電流密度增加了0.60±0.33倍;電位為-20mV時(shí),STOCs幅度和頻率分別增加了0.16±0.11倍和0.48±0.30倍。(6)雌激素受體抑制劑ICI182780對(duì)女性腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa宏觀電流及STOCs的作用:在+60 mV時(shí),加入100μM E后,BKCa電流密度

13、從15.89±4.87 pA/pF增加到27.88±6.75 pA/pF(P<0.01,n=23);在此基礎(chǔ)上加入100μM ICI182780后,其電流密度降低到20.15±6.21 pA/pF(P<0.05,n=23);電位為-20mV時(shí),加入100μM E后,STOCs的幅度和頻率分別從8.56±2.43 pA、2.98±0.77 Hz增加到14.75±3.78 pA(P<0.05,n=23)、4.70±1.57Hz(P<0.01

14、,n=23),在此基礎(chǔ)上加入100μM ICI182780后,STOCs的幅度和頻率分別降低到10.87±3.45pA(P<0.05,n=23)和3.52±0.98 Hz(P<0.05,n=23)(7)一氧化氮合酶抑制劑L-NAME對(duì)女性腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa宏觀電流及STOCs的作用:加入100μM E15min后,BKCa宏觀電流明顯被激活,在+60mV時(shí),BKCa電流密度從17.52±4.25增加到25.83±5.27 pA

15、/pF(P<0.05,n=4),在此基礎(chǔ)上加入600μM一氧化氮合酶抑制劑L-NAME,該電流明顯被抑制,BKCa電流密度降低到14.25±3.57 pA/pF(P<0.05,n=4);電位為-20mV時(shí),加入100μM E15min后,STOCs的幅度和頻率分別從7.24±3.27 pA和2.04±0.74 Hz增加到9.85±2.62 pA(P<0.05,n=4)和2.25±0.65 Hz(P<0.05,n=4),在此基礎(chǔ)上加入60

16、0μM一氧化氮合酶抑制劑 L-NAME,其幅度和頻率分別降低到6.24±1.86 pA(P<0.05,n=4)和1.65±0.54 Hz(P<0.05,n=4)。結(jié)論：(1)女性腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 BKCa宏觀電流具有明顯的電壓依賴性和外向整流特性;由 BKCa介導(dǎo)的STOCs的幅度和頻率具有顯著的電壓依賴性和隨機(jī)性。(2)雌激素可激活絕經(jīng)前女性PNH組、絕經(jīng)后女性NH組和EH組腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 BKCa宏觀電流及STOCs的幅度

17、和頻率,且 PNH組和NH組對(duì)雌激素反應(yīng)性比較,NH組較PNH組低,提示E對(duì)絕經(jīng)前女性的血管有一定的保護(hù)作用;絕經(jīng)后女性NH組和EH組對(duì)雌激素反應(yīng)性比較,EH組較NH低,提示高血壓后,血管對(duì)雌激素的反應(yīng)性下降,絕經(jīng)可能是高血壓發(fā)生發(fā)展的一個(gè)因素。(3)雌激素可引起女性腸系膜血管舒張,且雌激素受體特異性抑制劑 ICI182780能部分抑制該舒張效應(yīng),提示 BKCa和ER參與了雌激素舒張腸系膜血管的機(jī)制。(4)一氧化氮合酶抑制劑 L-NAM