左歸丸含藥血清促進大鼠骨髓間質細胞向肝細胞分化的研究.pdf

1、目的：研究左歸丸含藥血清對骨髓間質細胞分化為肝細胞的影響，探討中醫(yī)補腎生髓成肝的機制，為促進骨髓干細胞向肝細胞分化的研究奠定實驗基礎，為補腎治療肝病的臨床應用提供科學依據。 方法：體外培養(yǎng)Wister大鼠肝組織塊，收集其培養(yǎng)上清即為條件培養(yǎng)液。取Wister大鼠，隨機分組后分別用生理鹽水、中藥左歸丸濃縮煎劑、中藥八珍湯濃縮煎劑以10ml/kg的量灌胃，持續(xù)15天，第15天灌胃后2小時，頸動脈插管取血，離心后獲得正常大鼠血清、左歸

2、丸含藥血清、八珍湯含藥血清。采用貼壁分離，連續(xù)傳代培養(yǎng)的方法純化Wister大鼠骨髓間質細胞，反復傳代后分為6組。常規(guī)培養(yǎng)組始終使用常規(guī)培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液+體積分數20％胎牛血清+2mmol/L谷氨酸胺)進行培養(yǎng)；HGF誘導組以常規(guī)培養(yǎng)液+促肝細胞生長因子(HGF，25ng/ml)和地塞米松(10-7M)進行培養(yǎng)；HGF加左歸丸組以常規(guī)培養(yǎng)液+促肝細胞生長因子(HGF，25ng/ml)和地塞米松(10-7M)+10％的左歸丸含藥血清

3、進行培養(yǎng)；條件培養(yǎng)液加對照血清組以常規(guī)培養(yǎng)液+50％的條件培養(yǎng)液+10％正常大鼠血清進行培養(yǎng)；條件培養(yǎng)液加八珍湯組以常規(guī)培養(yǎng)液+50％的條件培養(yǎng)液+10％八珍湯含藥血清進行培養(yǎng)；條件培養(yǎng)液加左歸丸組以常規(guī)培養(yǎng)液+50％的條件培養(yǎng)液+10％左歸丸含藥血清進行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間持續(xù)28天，動態(tài)觀察細胞形態(tài)變化并于培養(yǎng)第0、7、14、21、28天時留取細胞，免疫細胞化學方法檢測肝細胞表面標記CK18、AFP、ALB的表達，PAS染色檢測糖原的表達

4、。各標本在統一放大倍數(400×)下，隨機選取數個視野，數陽性與陰性細胞數，計算陽性細胞率，比較不同培養(yǎng)組之間差異，兩樣本間均數比較采用t檢驗。 結果：誘導后約3天左右即有少量細胞形態(tài)開始變化，表現為肝細胞樣細胞形態(tài)；7～8天呈多邊形，胞漿豐富，核大；10天左右與肝細胞體外貼壁形態(tài)幾乎一樣。隨著誘導時間的延長，肝細胞樣的細胞數量也漸增多。誘導后28天，肝細胞樣的細胞仍存活。對照組的細胞仍然呈梭形，傳代至15代時細胞開始變得寬大、

5、扁平，逐漸脫壁死亡。左歸丸含藥血清能促進這一誘導作用，與對照組比較，在誘導后7、14、21、28天，肝細胞樣的細胞數量有顯著增加的同時，其形態(tài)更接近正常肝細胞。常規(guī)培養(yǎng)組細胞僅見極少數細胞表達AFP及ALB，各時間點比較陽性細胞率無顯著差異。HGF誘導組、HGF加左歸丸組、條件培養(yǎng)液加對照血清組、條件培養(yǎng)液加八珍湯組、條件培養(yǎng)液加左歸丸組等實驗組細胞0天時AFP、ALB僅極少數細胞表達，CK18及糖原未見表達；其總體趨勢表現為，AFP在

6、7天時表達明顯升高，14、21天時表達又快速減弱，28天時僅少數細胞表達；CK18、ALB及糖原在7天時少量表達，14、21、28天時表達明顯逐漸升高。誘導7天時，其AFP陽性細胞率HGF誘導組(63.2±2.6)、HGF加左歸丸組(78.9±3.1)、條件培養(yǎng)液加八珍湯組(43.0±2.3)和條件培養(yǎng)液加左歸丸組(82.5±3.0)，以上各含左歸丸藥物血清實驗組與對照組比較，差異顯著(P＜0.05)。誘導28天時，HGF誘導組其陽性細

7、胞率(％)CK18(60.7±2.3)、ALB(61.3±2.6)、糖原(52.6±2.7)；HGF加左歸丸組其陽性細胞率(％)CK18(72.6±2.7)，ALB(78.8±3.4)、糖原(69.2±2.8)；條件培養(yǎng)液加八珍湯組其陽性細胞率(％)CK18(62.8±2.3)，ALB(60.5±2.3)、糖原(59.8±2.4)；條件培養(yǎng)液加左歸丸組其陽性細胞率(％)CK18(82.2±2.9)，ALB(89.0±2.9)、糖原(89