左歸丸、右歸丸對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及osterix、oc基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:研究中醫(yī)經(jīng)典補(bǔ)腎方“左、右歸丸”含藥血清對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在不同時間成骨分化的影響，通過在顯微電鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞鑒定(FCM)、實(shí)時熒光定量(PCR)、甲基化特異性PCR(MSP)等核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察出補(bǔ)腎方劑左歸丸、右歸丸含藥血清7d時間對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化的影響、成骨基因Osterix（成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子）和oc（骨鈣素基因）表達(dá)及甲基化的水平。從實(shí)驗(yàn)的角度證明補(bǔ)腎

2、經(jīng)典方劑“左、右歸丸”的補(bǔ)腎作用，為中藥及成方提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　方法:以3周齡(40g±5g)的SD大鼠雙后肢骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為實(shí)驗(yàn)對象。在無菌條件下進(jìn)行SD大鼠股骨及脛骨的切取并提取骨髓，進(jìn)行SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)、傳代、純化，在通過CD29、CD34、CD45、CD90等抗體進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定(FCM);選擇12周齡的SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，按原方劑標(biāo)準(zhǔn)量熬制左歸丸、右歸丸藥液，按人和

3、動物體表面積折算的等效劑量每日兩次喂養(yǎng)SD大鼠連續(xù)3d，抽取其腹主動脈血液后離心制備左歸丸、右歸丸含藥血清;實(shí)驗(yàn)分為兩個觀察組:實(shí)驗(yàn)1組:正常對照組、左歸丸含藥血清組、成骨誘導(dǎo)液組;實(shí)驗(yàn)2組:正常對照組、右歸丸含藥血清組、成骨誘導(dǎo)液組;用osterix和oc為靶基因，檢測7d后的基因表達(dá)和其甲基化水平的變化規(guī)律。應(yīng)用Real time RT-PCR檢測osterix、oc成骨基因的表達(dá)情況。采用甲基化特異性PCR法檢測osterix、o

4、c基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:(1)通過流式細(xì)胞鑒定(FCM)技術(shù)對體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行檢測，體外培養(yǎng)的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)特性，證明了所研究的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。(2)在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中，含藥血清干預(yù)7天后，經(jīng)Real time RT-PCR檢測，結(jié)果為:實(shí)驗(yàn)A組:左歸丸組誘導(dǎo)osterix基因的表達(dá)明顯高于正常對照組、成骨誘導(dǎo)液組，組間比較差異明顯(P＜0

5、.05)。左歸丸組誘導(dǎo)的OC基因的表達(dá)明顯高于正常對照組、成骨誘導(dǎo)液組，組間比較差異明顯(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)B組:右歸丸組誘導(dǎo)osterix基因的表達(dá)明顯高于正常對照組、成骨誘導(dǎo)液組，組間比較差異明顯(P＜0.05)。右歸丸組誘導(dǎo)的OC基因的表達(dá)明顯高于正常對照組、成骨誘導(dǎo)液組，組間比較差異明顯(P＜0.05)。(3)在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中，含藥血清干預(yù)7天后，經(jīng)甲基化特異性PCR檢測，結(jié)果為:左歸丸組、右歸丸組osterix基因甲基化率明

6、顯低于成骨誘導(dǎo)液組、實(shí)驗(yàn)對照組，組間比較差異明顯(P＜0.05)。osterix基因甲基化程度依次為右歸丸組＜左歸丸組＜成骨誘導(dǎo)液組＜正常對照組。左歸丸組、右歸丸組OC基因甲基化率明顯低于成骨誘導(dǎo)液組、實(shí)驗(yàn)對照組，組間比較差異明顯(P＜0.05)。OC基因啟動子區(qū)域甲基化程度依次為左歸丸組＜右歸丸組＜成骨誘導(dǎo)液組＜正常對照組。
　　結(jié)論:(1)采用貼壁篩選法進(jìn)行體外分離、純化、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是切實(shí)可行的，將可形成一套完整的體

7、系。(2)補(bǔ)腎經(jīng)典方“左、右歸丸”含藥血清具備明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化。(3)補(bǔ)腎經(jīng)典方“左、右歸丸”含藥血清能通過上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨基因osterix、oc的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向成骨方向分化的作用。(4)補(bǔ)腎經(jīng)典方“左、右歸丸”能通過調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨基因osterix、oc啟動子區(qū)域低甲基化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，起促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨方