氰戊菊酯處理昆蟲細胞后蛋白表達變化及誘導(dǎo)P450表達分子機理.pdf

1、細胞色素P450(CytochromeP450/CYP)包含了一個色素蛋白的超家族，在各種生物的異生物質(zhì)包括藥物、殺蟲劑，各種污染物，自然界中的毒素以及各種生物內(nèi)源物質(zhì)如維生素，甾類激素等的代謝中起中心作用。有機合成殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，使目前已有至少500種以上的昆蟲和螨類對一種或者多種殺蟲劑發(fā)展了抗性。氰戊菊酯((RS)-α-氨基-3-苯氧基芐基(RS)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸酯，F(xiàn)envalerate)，是一種Ⅱ型擬除蟲菊酯

2、類化學(xué)殺蟲劑，具有高效、低毒、低殘留的突出優(yōu)點，然而多年的實際應(yīng)用已使一些昆蟲對其產(chǎn)生了抗性。大量相關(guān)研究亦表明P450s是對菊酯類殺蟲劑發(fā)揮主要作用的酶類，但對P450作用的分子機制卻了解的較少。本研究通過氰戊菊酯處理昆蟲Trichoplusiani(Tn)細胞，采用化學(xué)檢測、蛋白質(zhì)組學(xué)、及實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR等多種方法觀察處理過程中P450表達的變化及涉及的相關(guān)蛋白，對P450s的誘導(dǎo)作用機制及其與昆蟲抗藥性的關(guān)系做了有意義的探討，

3、本研究的結(jié)果對認識P450s參與的殺蟲劑抗性的發(fā)生發(fā)展機制和指導(dǎo)病媒防治具有重要意義。本研究獲得了以下試驗結(jié)果： 1、以不同濃度梯度氰戊菊酯處理昆蟲細胞Tn，并用臺盼蘭染色，MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol)-2，5-diphenyltrazoliumbromide)還原試驗及流式細胞儀檢測等方法對細胞的活力進行了測定。結(jié)果顯示，氰戊菊酯處理的濃度大于17.5μmol/L時，細胞的死亡率升高到29.69％以上

4、，極顯著高于對照(P＜0.01)，細胞對MTT試劑的還原物吸光值降低，細胞的相對活力極顯著下降(P＜0.01)；用流式細胞儀檢測的結(jié)果也證實，氰戊菊酯的濃度為25μmol/L時，死亡與凋亡的細胞數(shù)明顯高于對照。因此確定了不影響細胞活力的濃度范圍為0-15μM。 2、在前面細胞活力試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)置不影響細胞活力的氰戊菊酯濃度梯度處理Tn細胞12h，并以最適處理濃度-12.5μM氰戊菊酯分別處理Tn細胞0、3、6、9、12、24、

5、48h，提取微粒體，測定細胞中總P450s的含量。結(jié)果：P450s的含量隨氰戊菊酯濃度的增加而升高，并在氰戊菊酯濃度為12.5μM時達到最高(8.562nmol/mgprotein)，隨后下降；P450s的含量也隨處理時間的延長而升高，并在12h達到最高(5.28±1.14nmol/mgprotein)，隨后下降。因此，氰戊菊酯可誘導(dǎo)Tn細胞色素總P450s的變化，先隨濃度和處理時間增加到頂點后，過高的濃度和過長的處理時間反而抑制P45

6、0的含量。在處理濃度為12.5μM，處理時間12h時細胞總P450含量最高。 3、為了揭示昆蟲中細胞色素P450對氰戊菊酯代謝的機制，我們用雙向電泳展示了氰戊菊酯處理前后昆蟲細胞系(Tn)細胞總蛋白中各種蛋白表達量的變化，并對表達變化的蛋白用質(zhì)譜測定的方法予以鑒定。結(jié)果顯示，用雙向電泳分離出Tn細胞的1300多個蛋白中，有33個表達發(fā)生了變化，其中8個下調(diào)，25個上調(diào)。通過質(zhì)譜鑒定，其中有3個細胞色素P450的同工酶表達上調(diào)，其

7、它蛋白可能與P450表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。 4、按鑒定出的3個P450基因序列設(shè)計引物用于擴增該基因的cDNA片段并用半定量方式對比氰戊菊酯處理前后表達量對比，結(jié)果表明，擴增出的一個P450CYP4L4在處理后的的cDNA表達量顯著高于對照(P＜0.05)。此片段被克隆并在GeneBank中登錄。用實時定量方式對用氰戊菊酯各種梯度濃度、及在固定濃度不同時間梯度處理下Tn細胞的CYP4L4在mRAN水平表達變化進行測定，結(jié)果顯示

8、，這一變化與總的P450表達的模式相似。因此，氰戊菊酯可能通過已知的信號途徑誘導(dǎo)P450的表達，其中P450CYP4L4可能通過羥化的方式解毒氰戊菊酯。 5、通過二維液相色譜分離技術(shù)分析氰戊菊酯處理前后Tn細胞系蛋白質(zhì)譜的變化。結(jié)果顯示，對照組與處理組于一維各收集了44個組分，再經(jīng)二維各收集了1980個組分，其中有134個差異組分，42個組分上調(diào)，82個組分下調(diào)，從中鑒定出真核細胞轉(zhuǎn)錄因子及類似于負責(zé)果蠅嗅覺信號傳遞的穿膜受體。