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文檔簡介
1、研究背景:β腎上腺素能受體(β-AR)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族的重要成員。表達(dá)于心臟組織的β腎上腺素能受體可接受兒茶酚胺的刺激,從而將來自交感神經(jīng)系統(tǒng)的信息轉(zhuǎn)換為體內(nèi)生理學(xué)功能刺激信號(hào),從而調(diào)控心肌細(xì)胞的生物學(xué)功能,但其具體調(diào)控的機(jī)制尚未完全闡明。
Her2,原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)基因,人類表皮生長因子受體家族成員
2、之一。近年來,通過對(duì)Her2的基因敲除小鼠的研究,Her2在心肌細(xì)胞中的功能,特別是其在心肌細(xì)胞保護(hù)方面的作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。而且臨床上使用靶向Her2的治療性抗體赫賽汀(Herceptin)的應(yīng)用可在某些患者中引起明顯的心臟毒性,亦表明Her2在心肌細(xì)胞內(nèi)的作用至關(guān)重要,但是其機(jī)理尚不明確。
隨即,2006年,Alejandra Negro等研究發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞內(nèi)Her2與β2-AR存在相互作用,而且他們之間的這種相互作
3、用對(duì)于兒茶酚胺誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的活化及心肌細(xì)胞收縮功能的調(diào)控至關(guān)重要。研究者在文中明確指出Her2與β2-AR存的相互作用并非直接相互作用,而是可能通過某個(gè)支架分子介導(dǎo)的間接相互作用,具體機(jī)制不清楚。然而,2000年Borg等以HER2胞內(nèi)域殘基為釣餌,通過酵母雙雜交的方法從cDNA文庫中篩選到一種新的含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白,將其命名為ErbB2相互作用蛋白(ErbB2 interacting protein),簡寫為Erbin。
4、Erbin的序列分析表明,Erbin可能具有支架分子的功能,最近的相關(guān)研究也證明Erbin可作為支架蛋白介導(dǎo)Her2與其它受體分子發(fā)生相互作用。
我們的前期研究結(jié)果提示,在心肌細(xì)胞內(nèi)Erbin可能作為支架蛋白介導(dǎo)Her2與β2-AR之間的相互作用。隨后通過一系列的研究,我們發(fā)現(xiàn)Erbin的PDZ結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Her2與β2-AR之間的相互作用,并在β2-AR介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路活化中起到正向調(diào)控作用,本研究還首次報(bào)道了Erb
5、in在心肌細(xì)胞中的新功能。
目的:研究在細(xì)胞內(nèi),Erbin是否是作為支架蛋白介導(dǎo)Her2與β2-AR復(fù)合物形成的必要分子,及其揭示Erbin在心肌細(xì)胞中對(duì)β2-AR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路活化的調(diào)控作用,初步探索Erbin對(duì)心肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
方法:利用免疫共沉淀的方法,在心肌及腦組織初步驗(yàn)證Erbin、β2-AR及Her2三者存在相互作用;進(jìn)一步利用免疫共沉淀的方法,進(jìn)行內(nèi)源性,外源性檢測(cè)Erb
6、in、β2-AR及Her2三者存在相互作用;我們進(jìn)行內(nèi)源性敲低Erbin的表達(dá),利用免疫共沉淀證明Erbin是介導(dǎo)β2-AR與Her2復(fù)合物形成的必要分子,同時(shí)通過膜,漿分離實(shí)驗(yàn)來證明Erbin在兒茶酚胺激素下被招募到細(xì)胞膜上,是其發(fā)揮作用的前提。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建Erbin及其突變體,通過免疫共沉淀及免疫熒光的方法,確定Erbin介導(dǎo)β2-AR與Her2相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。通過SDS-PAGE和Western blot方法檢測(cè)E
7、rbin在ISO刺激β2-AR介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路中調(diào)控作用。進(jìn)一步通過TUNEL染色法檢測(cè)Erbin在心肌細(xì)胞內(nèi)抗調(diào)亡作用,利用胰酶消化法分離與培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞,通過慢病毒轉(zhuǎn)染高效敲低Erbin,熒光顯微鏡下觀察,記錄心肌細(xì)胞心率的變化,初步探索Erbin在心肌細(xì)胞內(nèi)潛在的生物學(xué)功能。
結(jié)果:首先,我們?cè)诖笫蟮男募〗M織及腦組織,初步驗(yàn)證了Erbin,β2-AR,Her2三者之間存在相互作用;接下來我們?cè)?93T(組
8、成性表達(dá)Erbin)細(xì)胞內(nèi),通過外源性過表達(dá)pcDNA3.0-β2-AR、pcDNA3.0-Her2兩種質(zhì)粒,證實(shí)Erbin、β2-AR及Her2三者之間存在相互作用;那么在心肌細(xì)胞是否也存在呢?我們研究證明在大鼠心肌細(xì)胞H9c2內(nèi)源性檢測(cè)結(jié)果,Erbin、β2-AR及Her2三者之間也存在相互作用。相反,如果敲低大鼠心肌細(xì)胞H9c2內(nèi)Erbin的表達(dá),是否會(huì)影響這種作用呢?我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌細(xì)胞H9c2內(nèi)敲低Erbin的表達(dá),E
9、rbin、β2-AR及Her2三者之間相互作用被破壞??梢?,Erbin是介導(dǎo)β2-AR與Her2兩者之間相互作用的必要分子。那么,Erbin是通過什么樣的機(jī)制介導(dǎo)了膜上蛋白分子之間的作用呢?我們的膜,漿分離實(shí)驗(yàn)證明Erbin在兒茶酚胺激素下被招募到細(xì)胞膜上,發(fā)揮其支架蛋白的作用。免疫共沉淀及免疫熒光的結(jié)果都證實(shí)Erbin的PDZ結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)β2-AR與Her2兩者之間相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。在隨后的實(shí)驗(yàn)中,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Erbin在β2-
10、AR介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路中正調(diào)控作用。此外,在我們的研究中,我們同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Erbin可保護(hù)心肌細(xì)胞免受兒茶酚胺慢性刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及Erbin可能在調(diào)控心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率中發(fā)揮重要作用。
結(jié)論:本研究證明Erbin PDZ結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Her2與β2-AR之間的相互作用以及Erbin在β2-AR介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路中起著正向調(diào)控作用;同時(shí)Erbin可保護(hù)心肌細(xì)胞免受兒茶酚胺慢性刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并初步揭示了Erbin可能在
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