蒿甲醚脂質(zhì)納米粒的制備及初步藥動(dòng)學(xué)研究.pdf

1、蒿甲醚（AM）在水中幾乎不溶，現(xiàn)有的制劑主要有油針、片劑、膠丸、膠囊等。蒿甲醚的口服制劑吸收快但不完全，前期研究表明多劑量口服給藥后藥物在體內(nèi)的總體清除率增大、血藥濃度下降，導(dǎo)致瘧疾的復(fù)發(fā)率較高，研究表明可能是藥物的自身誘導(dǎo)代謝所致，而靜脈注射給藥沒(méi)有自身誘導(dǎo)代謝現(xiàn)象。其油針用于惡性瘧的急救時(shí)通過(guò)肌內(nèi)注射給藥，雖然可能也不存在自身誘導(dǎo)作用，但該類(lèi)藥物主要作用于紅內(nèi)期的瘧原蟲(chóng)，通過(guò)靜脈注射給藥更有利于藥物快速發(fā)揮作用。本研究使用微乳法和高

2、壓乳勻法分別制備了蒿甲醚的脂質(zhì)納米粒（AM-NLC），所得NLC粒徑小，穩(wěn)定性好，體外釋放表現(xiàn)出緩釋特征，且無(wú)明顯的體外溶血效應(yīng)，通過(guò)大鼠尾靜脈注射及腹腔注射給藥后血藥濃度平穩(wěn)，有緩釋作用。
　　一．蒿甲醚脂質(zhì)納米粒的處方前研究
　　建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定蒿甲醚含量的方法。以Agilent-C18柱（150×4.6mm，5μm）為分析柱，以甲醇-水-冰醋酸（85.4:37.6:1，v/v/v，pH3.4）為流動(dòng)

3、相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，柱溫30℃，流速為1.0mL·min-1。該方法的線性范圍為100～900μg·mL-1。
　　使用搖瓶法測(cè)定蒿甲醚在正辛醇-水/緩沖體系中的表觀油水分配系數(shù)。在37℃下，蒿甲醚在正辛醇-水及pH5、pH6.8、pH7.4、pH8的磷酸鹽緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)（lgP）分別為：2.2、1.6、1.5、2.6、2.2。結(jié)果表明，蒿甲醚的脂溶性較大。pH在一定范圍內(nèi)變化時(shí)，蒿甲醚的表觀油水分配系數(shù)不同，但

4、變化幅度不大。
　　采用高效液相色譜法（HPLC）法測(cè)定蒿甲醚在各種介質(zhì)如注射用油、乳化劑及助乳化劑中的平衡溶解度。在37℃時(shí)，蒿甲醚在注射用油中鏈甘油三酯（MCT)、橄欖油、大豆油、蓖麻油及肉豆蔻酸異丙酯（IPM)中的平衡溶解度依次為：306.9，246.6，222.8，265.0，273.3mg·mL-1；在乳化劑(6mg·ml-1的膠束溶液)泊洛沙姆188（F68）、壬基酚聚氧乙烯醚（OP乳化劑）、聚山梨酯80、大豆卵磷脂、

5、聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40)中的平衡溶解度依次為：0.1，1.4，0.5，0.6，0.6mg·mL-1。在助乳化劑無(wú)水乙醇、1,2-丙二醇、丙三醇、異丙醇、正丁醇中的平衡溶解度依次為：177.3，37.0，3.4，204.1，303.1mg·mL-1。結(jié)果表明蒿甲醚在注射用油MCT、OP乳化劑、助乳化劑正丁醇中的平衡溶解度比較大。
　　二．蒿甲醚脂質(zhì)納米粒的處方篩選及優(yōu)化
　　本文使用微乳法(方法1）和高壓乳勻法（方法2）

6、兩種方法制備蒿甲醚脂質(zhì)納米粒（AM-NLC），并將高壓乳勻法制得的NLC進(jìn)行冷凍干燥得到其凍干粉，以增加制劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
　　在微乳法制備AM-NLC時(shí)，依據(jù)處方前研究的結(jié)果選擇三種備用的油、乳化劑、助乳化劑，并以單硬脂酸甘油酯（GMS）為固態(tài)脂質(zhì)，在一定的相比下制備空白NLC并繪制偽三元相圖，依據(jù)相圖中微乳區(qū)面積的大小進(jìn)行處方篩選。結(jié)果確定以GMS為固態(tài)脂質(zhì)、MCT為液態(tài)脂質(zhì)（油）、RH40為乳化劑、乙醇為助乳化劑、去離子水為

7、水相來(lái)制備N(xiāo)LC，并使用正交設(shè)計(jì)，以粒徑和包封率兩個(gè)指標(biāo)對(duì)處方進(jìn)行了優(yōu)化。
　　高壓乳勻法制備AM-NLC時(shí)，從輔料的安全性出發(fā)，并結(jié)合處方前研究結(jié)果，確定以GMS為固態(tài)脂質(zhì)、MCT為液態(tài)脂質(zhì)、RH40及F68為乳化劑、去離子水為水相來(lái)制備N(xiāo)LC。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了制備工藝（溫度、剪切速度、乳勻壓力及循環(huán)次數(shù)、乳化劑加入方式等）和處方因素（脂質(zhì)含量、乳化劑含量、兩種乳化劑的比例、AM的含量等）對(duì)NLC粒徑的影響，并使用正交設(shè)計(jì)，

8、以粒徑和包封率為指標(biāo)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化。將優(yōu)化后的NLC進(jìn)行冷凍干燥，使用復(fù)合凍干保護(hù)劑蔗糖和甘露醇，得到外觀良好、再分散性好的凍干粉。
　　三．蒿甲醚脂質(zhì)納米粒理化性質(zhì)的測(cè)定
　　由微乳法和高壓乳勻法制備的AM-NLC均為淡藍(lán)色的半透明液體，粒徑小且分布均勻。通過(guò)透射電鏡掃描，得到NLC的粒徑分布特征。通過(guò)超濾法測(cè)定優(yōu)化NLC的包封率，使用激光粒度儀對(duì)其粒徑及zeta電位進(jìn)行測(cè)定。微乳法制備的AM-NLC包封率為92.8％，平

9、均粒徑為30.0nm，zeta電位為-39.0mv；高壓乳勻法制備的AM-NLC包封率為83.8%，平均粒徑為61.5nm；高壓乳勻法制備的NLC凍干粉的包封率為72.2%，平均粒徑為225.1nm。
　　四．蒿甲醚脂質(zhì)納米粒的體外釋放試驗(yàn)及體外溶血試驗(yàn)
　　本文中采用透析袋擴(kuò)散法考察AM-NLC的體外釋放特征，透析袋的分子量閾值為10kDa。由于蒿甲醚在水中的溶解度較小，難以測(cè)定，所以以含20%乙醇的磷酸鹽緩沖液（PBS,

10、pH7.4）作為釋放介質(zhì)，并使用乙醚來(lái)萃取釋放液中的蒿甲醚進(jìn)行測(cè)定，低、中、高濃度下的萃取率均大于95%。微乳法制備的AM-NLC在48h內(nèi)的累積釋放率為80.6%，高壓乳勻法制備的AM-NLC凍干粉在48h內(nèi)的累積釋放率為83.9%。由釋放曲線可以看出，兩種方法制備的AM-NLC在前4h內(nèi)均有輕微的突釋現(xiàn)象，累積釋放率分別為27.2%，36.4%。之后隨著脂質(zhì)的不斷溶蝕，呈現(xiàn)出緩釋特征。
　　體外溶血試驗(yàn)考察NLC對(duì)家兔2%紅細(xì)

11、胞懸液的溶血作用，采用目視法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明兩種方法制備的AM-NLC在2h內(nèi)均無(wú)明顯的溶血作用，可供靜脈注射使用。
　　五．蒿甲醚脂質(zhì)納米粒的初步藥動(dòng)學(xué)研究
　　建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測(cè)定大鼠血漿中蒿甲醚（Artemether,AM）濃度的方法。以青蒿素（Artemisinin,ART）為內(nèi)標(biāo)，以乙腈-10mmol·L-1醋酸銨（含0.1%甲酸）（85:15，v/v）為流動(dòng)相，流速為0.6mL·m

12、in-1，以Agilent-C18（50×4.6mm,1.8μm）為色譜柱，采用電噴霧電離源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行陽(yáng)離子檢測(cè)，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z316.4→163.0（AM）和m/z300.8→209.0（ART）。該方法的線性范圍為5.0-500.0ng?mL-1，定量下限為5.0ng?mL-1。
　　雄性SD大鼠30只，每組6只，隨機(jī)分為5組，其中三組以尾靜脈注射方式分別給與AM溶液即對(duì)照組、微乳法制

13、備的AM-NLC及高壓乳勻法制備的AM-NLC，其余兩組以腹腔注射方式分別給予微乳法制備的AM-NLC及高壓乳勻法制備的AM-NLC，各組給藥劑量均為15mg?kg-1，在不同時(shí)間點(diǎn)從大鼠眼眶后靜脈叢采集血漿樣品，以LC-MS/MS法測(cè)定血漿藥物濃度并計(jì)算主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，腹腔注射組的達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為實(shí)測(cè)值。靜脈注射組的結(jié)果為：AM溶液組的t1/2為（2.3±1.1）h，AUC0-t為（885.4±295.3

14、）h·ng·mL-1，AUC0-∞為（919.5±314.3）h·ng·mL-1，CL為（4.4±1.4）L·h-1，V為（11±2.9）L；微乳法制備的AM-NLC組的t1/2為（7.7±2.4）h，AUC0-t為（1391.2±234.0）h·ng·mL-1，AUC0-∞為（1492.2±304.2）h·ng·mL-1，CL為（2.2±0.3）L·h-1，V為（12±2.4）L；高壓乳勻法制備的AM-NLC組的t1/2為（9.5±2

15、.2）h，AUC0-t為（1886.8±555.0）h·ng·mL-1，AUC0-∞為（2127.5±717.9）h·ng·mL-1，CL為（2.3±0.8）L·h-1，V為（15±6.1）L。腹腔注射組的結(jié)果為：微乳法制備的AM-NLC組的Cmax為（290.6±58.6）ng?mL-1，Tmax為（0.8±0.3）h，t1/2為（9.2±0.8）h，AUC0-t為（1158.1±349.9）h·ng·mL-1，AUC0-∞為（125

16、2.2±388.7）h·ng·mL-1，CL/F為（3.0±0.8）L·h-1，V/F為（15±2.6）L；高壓乳勻法制備的AM-NLC組的Cmax為（341.8±53.2）ng?mL-1，Tmax為（0.7±0.3）h，t1/2為（9.6±4.1）h，AUC0-t為（1599.8±150.6）h·ng·mL-1，AUC0-∞為（1636.8±237.9）h·ng·mL-1，CL/F為（2.2±0.6）L·h-1，V/F為（13±3.8