FGF、BMP、WNT信號通道對乳鼠耳蝸神經(jīng)發(fā)育及谷氨酸鈉耳毒性作用的影響初步研究.pdf

1、第一章乳鼠耳蝸信號通道基因表達 目的:不同的信號通道(FCF、BMP、WNT等)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能有密切的關(guān)系。同時，F(xiàn)GF、BMP、WNT等對神經(jīng)元的發(fā)育及存活及對神經(jīng)元損傷后的修復(fù)起重要作用。目前對于信號通道在中樞神經(jīng)功能方面的研究已取得重大進展，提示內(nèi)耳可能存在類似機制。本部分先檢測FGF、BMP、WNT相關(guān)基因在耳蝸的表達，為進一步研究提供支持。 方法:以出生一天(P1)的BALB/C乳鼠為研究對象，無菌條件下取出

2、耳蝸，于低血清DMEM/F-12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)(每組20個)。設(shè)計引物，運用Trizol一步法抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測，并以測序證實。 結(jié)果:本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各實驗組Nudt6、Bmp4、Wnt7a、six1、six4、fas、bcl-2、β-actin均在耳蝸有明顯表達，其中Nudt6是首次發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳有表達。 結(jié)論:本實驗成功證實在乳鼠(P1)耳蝸部分信號通道及凋亡基因有表達，bFGF的反義調(diào)控基因-Nud

3、t6在內(nèi)耳表達，提示它們在內(nèi)耳發(fā)育調(diào)控中具有一定意義。 第二章信號通道與內(nèi)耳神經(jīng)發(fā)育初步研究 目的:在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，不同信號通道對于神經(jīng)元的發(fā)育、分化起著重要作用。但是對內(nèi)耳神經(jīng)系統(tǒng)的作用還存在爭議。在體外阻斷耳蝸的BMP，WNT信號途徑，觀察其對耳蝸神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的影響及形態(tài)變化，為進一步理解這些基因的功能和下一步研究提供基礎(chǔ)。 方法:在離體耳蝸(每組20個)，以Noggin阻斷BMP，以Wif-1阻斷WNT

4、信號通道，同時在培養(yǎng)基中添加bFGF蛋白。離體耳蝸經(jīng)短程培養(yǎng)后，抽提RNA，并行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測。耳蝸組織行TUNEL檢測神經(jīng)元凋亡情況。 結(jié)果:在試驗組耳蝸出現(xiàn)sixl(3.3061±0.1454)，six4(6.6179±0.5069)，bcl-2(3.8766±0.3112)基因表達增高，Nudt6(0.4672±0.0430)表達下調(diào)，但耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡無顯著改變。 結(jié)論:阻斷BMP、WNT途徑并以bF

5、GF處理后，在耳蝸誘導(dǎo)Six1，six4，bcl-2產(chǎn)生，Nudt6表達水平下降，fas表達無明顯改變，提示信號通道被改變后凋亡被抑制，表現(xiàn)出促進耳蝸螺旋神經(jīng)元發(fā)育的趨勢。 第三章信號通道對谷氨酸鈉耳毒性作用的影響初步研究 目的:谷氨酸鈉是神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的調(diào)節(jié)因子，過量谷氨酸鈉對內(nèi)耳神經(jīng)元有明顯毒性作用，但是在這個過程中各個信號通道是否發(fā)揮作用，如何發(fā)揮作用有待研究。本研究將谷氨酸鈉在體外作用于耳蝸，再阻斷信號通道，以

6、定量逆轉(zhuǎn)錄PCR、組織化學(xué)方法檢測神經(jīng)發(fā)育相關(guān)指標。 方法:以谷氨酸鈉(200 u M)處理培養(yǎng)離體耳蝸組織，分別加入Noggin(5ug/ml)，Wif-1(2ug/ml)及bFGF(10ng/ml)。抽提RNA并行定量PCR檢測，耳蝸組織行TUNEL檢測神經(jīng)元凋亡。 結(jié)果:谷氨酸鈉處理后fas表達(76.0933±7.2652)明顯高于bcl-2(9.6117±1.5023)，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡增加，Nudt6(