鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠海馬谷氨酸代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、鉛是環(huán)境中廣泛存在的重金屬污染物，具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。兒童是鉛暴露的易感人群，研究顯示，鉛可對(duì)兒童的學(xué)習(xí)記憶功能造成永久性的損傷。迄今，在鉛對(duì)學(xué)習(xí)、記憶損害方面的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但其具體機(jī)制仍不清楚，還有待進(jìn)一步的研究。
　　谷氨酸(glutamate，Glu)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，也是與LTP的誘導(dǎo)與維持等腦高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān)的重要神經(jīng)遞質(zhì)。Glu也具有興奮性神經(jīng)毒性，細(xì)胞外過多的

2、Glu可引起神經(jīng)元的損傷，甚至死亡。谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元代謝偶聯(lián)的重要途徑之一，其在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Glu的正常代謝、清除突觸間隙內(nèi)Glu、防止Glu對(duì)神經(jīng)元的興奮性毒性中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte，AS）是腦組織中數(shù)量最多的細(xì)胞群體，其功能不僅僅是支持、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，它還參與突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)的清除與代謝、促進(jìn)突觸的形成與參與突觸可塑性的調(diào)控。AS上表達(dá)高親和力的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)

3、體，包括GLAST(Glutamate/Aspartatetransporter)和GLT-1（Glutamate transporter-1）。此外，AS內(nèi)還表達(dá)其獨(dú)有的谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase，GS）。故AS不僅能快速清除突觸間隙的Glu，而且能對(duì)攝入的Glu進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化。故如果AS內(nèi)的鉛引起Glu代謝相關(guān)環(huán)節(jié)的損傷，將嚴(yán)重干擾谷氨酸能神經(jīng)突觸的信息傳遞，損傷腦的學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)，成為鉛神經(jīng)毒性

4、的初始損傷環(huán)節(jié)之一。
　　基于以上理論，本研究以昆明種小鼠為研究對(duì)象，通過探討鉛對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠海馬組織中Glu代謝相關(guān)環(huán)節(jié)的影響，為揭示鉛神經(jīng)毒作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與染毒
　　選擇健康、清潔級(jí)昆明種小鼠的孕鼠80只，隨機(jī)分成對(duì)照組及0.5、1.0和2.0 g/L乙酸鉛暴露組。從受孕第一天開始以自由飲水方式染鉛，對(duì)照組孕鼠飲蒸餾水。分娩后，各實(shí)驗(yàn)組的母鼠和仔鼠繼續(xù)飲含鉛水

5、至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　2、指標(biāo)測(cè)定
　　乙醚麻醉后，分別斷頭處死出生后(postnatal day, PND)10、20和40天的仔鼠，快速取腦組織，低溫下剝離雙側(cè)海馬，稱重。
　　2.1仔鼠腦鉛含量測(cè)定
　　采用石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)不同發(fā)育階段仔鼠腦組織鉛含量。2.2仔鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力的測(cè)定
　　用Morris水迷宮法檢測(cè)PND40仔鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力，測(cè)試包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。

6、
　　2.3仔鼠海馬中GS活性測(cè)定
　　采用南京建成生物工程研究所的GS活性試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，于酶標(biāo)儀上測(cè)定550 nm處OD值。
　　2.4仔鼠海馬中GS、GLAST和GLT-1 mRNA和蛋白表達(dá)測(cè)定
　　采用Real time RT-PCR法和Western-blot法檢測(cè)不同發(fā)育階段仔鼠海馬中GS、GLAST和GLT-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3、統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0

7、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1、鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠體重增長(zhǎng)的影響
　　各染鉛組的PND10和20仔鼠體重與對(duì)照組比較未見顯著差異，僅2.0 g/L染鉛組的PND40仔鼠體重顯著低于對(duì)照組。
　　2、鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠腦臟器系數(shù)的影響
　　各染鉛組的PND10和20仔鼠腦臟器系數(shù)與

8、對(duì)照組比較均未見顯著差異，僅2.0 g/L染鉛組的PND40仔鼠腦臟器系數(shù)顯著高于對(duì)照組及0.5 g/L和1.0 g/L染鉛組。
　　3、鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠腦鉛含量的影響
　　2.0 g/L染鉛組的PND10、20和40仔鼠腦鉛含量均顯著高于對(duì)照組及其它染鉛組，1.0 g/L染鉛組的PND20和40仔鼠及0.5 g/L染鉛組的PND40仔鼠腦鉛含量也顯著高于對(duì)照組。
　　4、鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠空間學(xué)習(xí)與記憶

9、能力的影響
　　在定位航行實(shí)驗(yàn)中，各染鉛組的PND40仔鼠的尋找平臺(tái)潛伏期從訓(xùn)練第2天起，隨染鉛劑量的增加而延長(zhǎng)，且各染鉛組與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;從訓(xùn)練第3天起，2.0 g/L染鉛組與其它染鉛組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;從訓(xùn)練第4天起，各染鉛組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　在空間探索實(shí)驗(yàn)中，各染鉛組的PND40仔鼠在第Ⅱ象限停留時(shí)間隨染鉛劑量的增加而減少，其中1.0和2.0 g/L染鉛組與對(duì)照組和0.5 g/L染鉛組的差

10、異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外，2.0 g/L染鉛組與1.0 g/L染鉛組的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠海馬中GS活性的影響
　　2.0 g/L染鉛組的PND10、20和40仔鼠、1.0 g/L染鉛組的PND20和40仔鼠及0.5 g/L染鉛組的PND40仔鼠的海馬中GS酶活性均顯著低于對(duì)照組;此外，2.0 g/L染鉛組的PND20和40仔鼠的海馬中GS酶活性也顯著低于0.5 g/L鉛暴露組。
　　6

11、、鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠海馬中GS表達(dá)的影響
　　2.0 g/L染鉛組的PND40仔鼠海馬中GS mRNA含量顯著低于對(duì)照組;各染鉛組的PND10和20仔鼠與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.0 g/L染鉛組的各發(fā)育階段仔鼠海馬中GS蛋白水平均顯著低于對(duì)照組及其它染鉛組;1.0 g/L染鉛組的不同發(fā)育階段仔鼠海馬中GS蛋白水平均顯著低于對(duì)照組，其中PND20和40仔鼠的海馬中GS蛋白水平也顯著低于0.5 g/L染鉛組;

12、0.5 g/L染鉛組的不同發(fā)育階段仔鼠與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7、鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠海馬中GLAST表達(dá)的影響
　　2.0 g/L染鉛組的PND40仔鼠海馬中GLAST mRNA含量顯著低于對(duì)照組和0.5 g/L染鉛組;1.0 g/L染鉛組的PND40仔鼠海馬中GLAST mRNA含量顯著低于對(duì)照組;各染鉛組的PND10和20仔鼠海馬中GLAST mRNA含量與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.0

13、 g/L染鉛組的PND20和40仔鼠海馬中GLAST蛋白水平均顯著低于對(duì)照組及其它染鉛組，1.0 g/L染鉛組的PND20和40仔鼠海馬中GLAST蛋白水平也顯著低于對(duì)照組。各染鉛組的PND10仔鼠海馬中GLAST蛋白水平與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　8、鉛暴露對(duì)不同發(fā)育階段仔鼠海馬中GLT-1表達(dá)的影響
　　2.0 g/L染鉛組的PND40仔鼠海馬中GLT-1 mRNA含量顯著低于對(duì)照組及其它染鉛組;各染鉛組的PND

14、10和20仔鼠與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.0 g/L染鉛組的各發(fā)育階段仔鼠海馬中GLT-1蛋白水平顯著低于對(duì)照組及其它染鉛組;1.0 g/L染鉛組的PND20和40仔鼠海馬中GLT-1蛋白水平均顯著低于對(duì)照組及0.5 g/L染鉛組。
　　結(jié)論：
　　1、發(fā)育早期飲水鉛暴露可引起不同發(fā)育階段仔鼠腦鉛含量隨染鉛濃度與時(shí)間的增加而不斷累積。
　　2、飲水鉛暴露可明顯損傷仔鼠的空間學(xué)習(xí)能力，較高水平鉛暴露對(duì)仔