190CT3多肽調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞增殖分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：白血病是起源于造血干細(xì)胞的惡性疾病,俗稱(chēng)血癌。白血病細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)：增殖失控、分化障礙、凋亡受阻,白血病細(xì)胞大量增生累積,而使得正常造血功能受到抑制,至今無(wú)有效治療方法。目前,科學(xué)家提出人體所有疾病都可以從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常的角度重新認(rèn)識(shí),細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和各種疾病發(fā)生機(jī)制的闡明,使得很多信號(hào)分子可以作為治療這些疾病的藥物篩選靶位,由此產(chǎn)生了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物。 白血病抑制因子是一種細(xì)胞因子,最早于1988年在小

2、鼠KrebsⅡ腹水瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液中被純化,因其能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株M1細(xì)胞向正常細(xì)胞分化,故稱(chēng)白血病抑制因子。LIF因子是一種多功能的細(xì)胞因子,它能夠抑制HL-60,K562,U937等白血病細(xì)胞的增殖。同時(shí)LIF對(duì)于干細(xì)胞的增殖分化也有廣泛的調(diào)節(jié)作用,最典型的生物學(xué)功能是抑制胚胎干細(xì)胞的分化,維持其增殖和干細(xì)胞的多能性。LIF的生物學(xué)效應(yīng)是其首先與LIF受體的a亞基(gp190)結(jié)合,并使之與另一β亞基(gp130)結(jié)合,形成異源性

3、二聚化結(jié)構(gòu),從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使胞外的信息傳入核內(nèi),調(diào)控特定基因的表達(dá),使細(xì)胞發(fā)生一系列的變化。在LIF調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞增殖分化的過(guò)程中,JAK-STATS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是LIF產(chǎn)生活性的重要途徑,而在眾多的STATS分子,STAT3信號(hào)分子的激活與調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的分化最為密切。 gp190(LIFRα亞基)是低親和力的LIF特異性受體,屬于造血細(xì)胞受體超家族,其缺乏內(nèi)生激酶的活性。生理狀態(tài)下存在可溶性LIFR和跨膜LIFR

4、?？扇苄允荏w,游離于胞外,沒(méi)有跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)。跨膜的LIFR(gp190)胞內(nèi)區(qū)含有三個(gè)功能域--BOX1、BOX2和BOX3。YXXQ結(jié)構(gòu)是激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需序列,位于遠(yuǎn)膜端(Y酪氨酸,X任意氨基酸,Q谷氨酰胺),它能與STAT3的SH2位點(diǎn)特異性識(shí)別結(jié)合,是STAT3磷酸化的必須結(jié)構(gòu)。Hermanns證實(shí)LIF受體a亞基細(xì)胞內(nèi)區(qū)近膜端與STAT3結(jié)合,遠(yuǎn)膜端激活STAT3。Tomida等研究發(fā)現(xiàn),LIFR gp190亞基胞內(nèi)

5、區(qū)具有信號(hào)傳導(dǎo)的功能。有關(guān)膜受體信號(hào)啟動(dòng)位點(diǎn)的游離多肽對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響也已有相關(guān)的報(bào)道,單一亞基的單一信號(hào)啟動(dòng)位點(diǎn)在離膜狀態(tài)下完全能夠在細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 在我們以往的研究工作中發(fā)現(xiàn),在沒(méi)有LIF因子的誘導(dǎo)下,高表達(dá)的LIFRa亞基也可使白血病細(xì)胞下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活。按照LIFRa亞基細(xì)胞內(nèi)區(qū)第三個(gè)功能域(Box3)設(shè)計(jì)一種小分子--190CT3,并使其在白血病細(xì)胞內(nèi)表達(dá),通過(guò)檢測(cè)JAK/STAT3及P44/

6、42 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游信號(hào)分子及其磷酸化水平,研究發(fā)現(xiàn)其確實(shí)具有LIF受體的信號(hào)啟動(dòng)效應(yīng)從而抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)動(dòng)物裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),HL-60-190CT3細(xì)胞株注射的裸鼠與其他兩組(HL-60和HL-60-3.0細(xì)胞)相比脾臟、腎臟、肝臟以及肺等組織內(nèi)的腫瘤細(xì)胞增生、充血水腫明顯減少,HE染色后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：多個(gè)器官血管增生和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯低于其他兩組,證明其轉(zhuǎn)染了目的基因190CT3的白血病細(xì)胞毒性明

7、顯降低。 本實(shí)驗(yàn)研究目的著重于鑒定并明確190CT3多肽的活性和功能,制備并獲取190CT3多肽,進(jìn)一步為成功研制對(duì)白血病細(xì)胞有較特異殺傷作用的新的生物學(xué)藥物提供臨床應(yīng)用依據(jù)。 研究方法：本實(shí)驗(yàn)首先獲得了重組190CT3和190CT3-myc兩種CHO表達(dá)細(xì)胞株,以高效表達(dá)目的基因的CHO細(xì)胞作為蛋白供體。將獲得高效表達(dá)目的基因的CHO細(xì)胞株與HL-60細(xì)胞共培養(yǎng)。利用RT-PCR,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、westernblo

8、t,流式細(xì)胞儀,AO/EB,Annexin-V/PI,激光共聚焦等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,從細(xì)胞形態(tài)觀察,蛋白表達(dá)量高低的鑒定,分子磷酸化水平等方面分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)和粒細(xì)胞表面抗原CD15在共培養(yǎng)后白血病細(xì)胞的變化,分析190CT3多肽是否可以啟動(dòng)白血病細(xì)胞下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而抑制白血病細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其在一定程度的分化。另一方面我們也通過(guò)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),排除了其誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用。并通過(guò)親和層析的方法分離純化

9、獲得190CT3功能多肽。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)構(gòu)建190CT3-mvc cDNA表達(dá)載體：藉HindⅢ和Xba I位點(diǎn)將目的片段重組于T載體中。然后轉(zhuǎn)化入DH5a中,涂平板、挑克隆,用HindⅢ和XbaI酶切鑒定,證實(shí)重組質(zhì)粒中含有預(yù)期大小的片段(400bp左右),挑選含有插入片段的重組子T-190CT3myc進(jìn)行測(cè)序,且無(wú)堿基突變。將目的片段酶切后重新連入真核表達(dá)載體pcDNA3.0中,成功構(gòu)建重組pcDNA3.0-190CT3m

10、yc的真核表達(dá)載體。2)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,將空載體和兩種重組子分別導(dǎo)入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞,G418篩選(終濃度2800ug/ml),挑選G418陽(yáng)性克隆。成功構(gòu)建了三種細(xì)胞株:pcDNA3.0-190CT3重組子CHO細(xì)胞株(CHO-190CT3)、pcDNA3.0-190CT3myc重組子CHO細(xì)胞株(CHO-190CT3myc)、pcDNA3.0 CHO細(xì)胞株(CHO-3.0);3)RT-PCR檢測(cè)到190CT3在mRNA水平

11、上的表達(dá)。挑取表達(dá)目的基因比較高的細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),細(xì)胞免疫熒光化學(xué)和westernblot均檢測(cè)到190CT3多肽的表達(dá),而轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載體的CHO細(xì)胞未檢測(cè)到190CT3多肽的表達(dá)。共培養(yǎng)后白血病細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變:CHO-190CT3細(xì)胞株與HL-60和K562細(xì)胞共培養(yǎng)1周后,共培養(yǎng)后的HL-60和K562細(xì)胞與野生型HL-60細(xì)胞相比細(xì)胞體積變大,形狀變得不規(guī)則,K562細(xì)胞呈明顯的氣球樣變。而與CHO-3.0細(xì)胞株

12、共培養(yǎng)1周后的HL-60和K562細(xì)胞形狀規(guī)則,變化不明顯。4)Western blot檢測(cè)細(xì)胞核增值抗原PCNA的表達(dá)水平,與CHO-190CT3共培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞株P(guān)CNA的表達(dá)水平低于其他兩組；4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)粒細(xì)胞表面抗原CD 15發(fā)現(xiàn),與CHO-190CT3共培養(yǎng)的HL-60和K562細(xì)胞CD15陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于其他兩組細(xì)胞；5)westernblot檢測(cè)下游信號(hào)分子STAT3和STAT3磷酸化水平發(fā)現(xiàn)與CHO-19

13、0CT3共培養(yǎng)HL-60細(xì)胞組與其他兩組細(xì)胞相比,STAT3及其磷酸化水平升高；激光共聚焦顯示較強(qiáng)于其它兩組的陽(yáng)性信號(hào)并且有STAT3信號(hào)分子入核。6)吖啶橙(AO)/溴乙錠(EB)和Annexin-V/PI雙染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,三組細(xì)胞均未見(jiàn)有明顯的凋亡現(xiàn)象。因此排除了190CT3多肽對(duì)白血病細(xì)胞的促凋亡作用。 本研究結(jié)果表明：190CT3重組子可以在CHO細(xì)胞中表達(dá),通過(guò)與白血病細(xì)胞共培養(yǎng)的方法,檢測(cè)JAK/STAT3