缺氧缺營養(yǎng)對(duì)腫瘤來源自噬小體DAMP的影響及其誘導(dǎo)IL-10+B細(xì)胞的研究.pdf

1、腫瘤發(fā)生早期，腫瘤組織通過周圍正常組織的血液循環(huán)系統(tǒng)供給氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，隨著腫瘤快速生長，新生血管形成，但其供血供氧能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足腫瘤組織快速增殖的要求，因此，腫瘤組織長期處于缺血缺氧狀態(tài)。在腫瘤組織微環(huán)境中，因能量缺乏而壞死的腫瘤細(xì)胞會(huì)向細(xì)胞間或血液循環(huán)中釋放危險(xiǎn)相關(guān)模式分子(Danger-associatedmolecular-pattern,DAMP)，如HMGB1、HSP90等。
　　目前認(rèn)為，自噬是細(xì)胞應(yīng)對(duì)營養(yǎng)缺乏、氧

2、化應(yīng)激、低氧、感染等惡劣環(huán)境因素的生存機(jī)制之一，細(xì)胞可以通過自噬，直接降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子回收再利用，抵抗凋亡，在不利環(huán)境下存活。前期研究表明，腫瘤細(xì)胞來源自噬小體(tumor releasedautophagosome，TRAP)能誘導(dǎo)B細(xì)胞成為分泌高水平IL-10、對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答具有抑制功能的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(IL-10+Breg)，但缺氧、缺營養(yǎng)條件是否上調(diào)DAMP的表達(dá)、胞內(nèi)DAMP是否被包裹入TRAP以及攜帶不同含量DAMP的TRA

3、P是否影響IL-10+Breg的誘導(dǎo)還有待進(jìn)一步研究。
　　目的:
　　1、探討缺氧、缺營養(yǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞及其TRAP中DAMP的影響;
　　2、探討缺氧、缺營養(yǎng)條件下獲得的TRAP對(duì)誘導(dǎo)B細(xì)胞成為IL-10+B細(xì)胞及其功能的影響。
　　方法:
　　1、檢測(cè)不同細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)TRAP中是否存在DAMP及其含量
　　1.1 檢測(cè)正常狀態(tài)下人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721、Huh7來源自噬小體中DAMP

4、表達(dá)水平;
　　1.2 檢測(cè)不同培養(yǎng)條件HepG2細(xì)胞中DAMP表達(dá)水平;
　　1.3 檢測(cè)不同培養(yǎng)條件HepG2-TRAP中DAMP含量;
　　2、檢測(cè)不同培養(yǎng)條件TRAP對(duì)B細(xì)胞成為IL-10+B細(xì)胞的影響，及對(duì)IL-10+B細(xì)胞功能的影響
　　2.1 將不同培養(yǎng)條件HepG2-TRAP與健康供體B細(xì)胞共孵育72小時(shí)，檢測(cè)IL-10+B細(xì)胞比例，及培養(yǎng)上清中IL-10水平;
　　2.2 將不同培養(yǎng)狀態(tài)T

5、RAP誘導(dǎo)的IL-10+B細(xì)胞加入抗CD3單抗刺激PBMC的體外增殖體系，96小時(shí)后檢測(cè)CD4+T和CD8+T細(xì)胞CFSE衰減情況。
　　結(jié)果:
　　1、不同培養(yǎng)狀態(tài)募集的TRAP中DAMP含量存在差異
　　1.1 不同人肝癌細(xì)胞株TRAP中DAMP含量存在差異。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRAP表面HMGB1含量，我們發(fā)現(xiàn)SMMC7721-TRAP中HMGB1平均熒光強(qiáng)度(MFI)明顯高于Huh7-TRAP和HepG2-TR

6、AP(102vs31vs27); Western blot檢測(cè)TRAP中HMGB1和HSP90含量，通過比較相對(duì)灰度值，可知7721-TRAP中HMGB1含量明顯高于Huh7-TRAP和HepG2-TRAP(67％vs45％vs37％)，7721-TRAP中HSP90亦高于Huh7-TRAP和HepG2-TRAP(90％vs68％vs62％)。
　　1.2 缺氧上調(diào)細(xì)胞中DAMP含量，缺營養(yǎng)上調(diào)細(xì)胞自噬水平。通過Western b

7、lot檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1、HSP90、LC3含量，通過比較相對(duì)灰度值，可知缺氧條件下細(xì)胞中HMGB1的含量較正常條件和缺營養(yǎng)條件明顯增加(95％ vs50％vs68％)，HSP90含量亦高于正常條件和缺營養(yǎng)條件(98％vs38％vs47％);缺營養(yǎng)條件下細(xì)胞中LC3-Ⅱ含量相較于正常條件和缺氧條件明顯增加(94％vs15％vs18％)。
　　1.3缺氧上調(diào)TRAP中DAMP含量。通過質(zhì)譜分析比對(duì)缺氧條件TRAP和正常條件TRAP

8、，發(fā)現(xiàn)HMGB1和HSP90在缺氧條件下含量均增加;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRAP表面HMGB1含量，我們發(fā)現(xiàn)缺氧條件TRAP中HMGB1的平均熒光強(qiáng)度(MFI)明顯高于正常條件TRAP(128vs29)，缺營養(yǎng)條件TRAP中HMGB1的平均熒光強(qiáng)度(MFI)與正常條件相比無明顯差異(31vs29);通過Western blot檢測(cè)TRAP中HMGB1、HSP90含量，通過比較相對(duì)灰度值，可知缺氧條件下TRAP中HMGB1的含量較正常條件和

9、缺營養(yǎng)條件明顯增加(127％vs30％vs48％)，HSP90含量亦高于正常條件和缺營養(yǎng)條件(135％vs76％vs120％)。
　　2、缺氧、缺營養(yǎng)狀態(tài)下募集的TRAP誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10及抑制T細(xì)胞增殖的能力明顯強(qiáng)于普通培養(yǎng)條件下募集的TRAP，其中與TRAP的DAMP含量相關(guān)。
　　2.1 缺氧條件TRAP誘導(dǎo)B細(xì)胞成為IL-10+B的比例高于缺營養(yǎng)條件TRAP和正常條件TRAP(7.4％vs4.6％vs3.6％)

10、;培養(yǎng)上清中IL-10的含量亦高于缺營養(yǎng)條件TRAP和正常條件TRAP(147vs45vs40)(9pg/mL);其產(chǎn)生的IL-10+B對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖功能的抑制也高于缺營養(yǎng)條件TRAP和正常條件TRAP(43.8％vs48.7％vs50.5％)，CD8+T細(xì)胞增殖水平均低于對(duì)照組的61.7％; CD4+T細(xì)胞亦得到相似的結(jié)果。
　　2.2 通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析TRAP中HMGB1和HSP90含量與其誘導(dǎo)IL-10+B細(xì)胞的相關(guān)性，

11、可知TRAP中HMGB1含量與其誘導(dǎo)IL-10+B細(xì)胞高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.869，p＜0.001; TRAP中HSP90含量與其誘導(dǎo)IL-10+B細(xì)胞亦具有一定相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.589，p＜0.05。TRAP中HMGB1含量與上清中IL-10含量高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.713，p＜0.05，TRAP中HSP90含量與上清中IL-10含量不具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.537，p=0.072，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3 封閉TR