DNA氧化損傷修復基因HOGG1低表達細胞株的建立及其應用研究.pdf

1、DNA損傷與修復一直是毒理學和腫瘤學研究的熱點，在眾多DNA損傷中，以自由基(freeradical)引起的DNA氧化損傷(oxidativeDNAdamage)研究最多，被認為是啟動和促進腫瘤發(fā)生最為重要的因素。大量研究表明：活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)自由基可以直接攻擊生物大分子DNA，誘發(fā)DNA鏈斷裂和多種形式的堿基修飾。在各種DNA氧化損傷中，以鳥嘌呤8位碳原子的氧化最常見，其氧化產(chǎn)物8-羥基-脫

2、氧鳥嘌呤(7，8-dihydro-8-oxoguanine,8-OHdG)在體內形成后較為穩(wěn)定、易于檢測，被公認為DNA氧化損傷的生物標志物(biomarker)。此外，8-OHdG最特征、最具生物學意義的危害是：DNA鏈中的鳥嘌呤G被氧化成8-OHdG后可導致DNA鏈空間構象的改變，在DNA合成時8-OHdG優(yōu)先或等效率地與腺嘌呤A配對，從而導致DNA鏈G：C-＞T：A顛換，該顛換在腫瘤形成中發(fā)生最早，常見于癌基因ras和抑癌基因p5

3、3中，故此突變被認為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、機體細胞的老化和某些退行性疾病的發(fā)生都具有密切的關系。 人體細胞中，特異性切除和修復8-OHdG的酶是8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(human8-oxoguanineDNAglycosylase，簡稱HOGG1)，具有切除DNA雙鏈中與堿基C配對的8-OHdG的作用，從而恢復基因組中正常的G：C配對，在維持基因組穩(wěn)定和腫瘤預防上具有舉足輕重的作用，編碼該蛋白的基因hOGG1于1997年成功克隆

4、。 人群流行病學研究顯示：hOGG1基因在不同人群存在遺傳多態(tài)性，并與癌癥易感性密切相關，其突變或缺失將增加個體罹患腫瘤的風險。目前，關于hOGG1基因與環(huán)境致癌物作用的報道還不多，研究的物質種類也很有限。此外，有關hOGG1與氧化損傷和癌癥的關系的研究結果也不盡一致，有的研究顯示外來化合物誘導DNA氧化損傷時，hOGG1表達下降，酶活性降低，組織中8-OHdG增加；而有的報道則相反。目前，國外正在從各個方面蓬勃開展其研究，國內

5、的報道相對較少。本研究擬采用核酶技術和分子克隆技術建立hOGG1基因低表達的細胞株，這將為深入研究DNA氧化損傷和修復以及與癌癥的關系提供一個十分有效的毒理學實驗工具。 核酶(ribozyme)技術屬于反義核酸技術之一，是繼基因克隆之后的又一全新分子生物學技術。核酶是一類具有核酸內切酶活性、能序列特異性地剪切mRNA的RNA分子，設計合理的核酶能與被選擇的靶mRNA片段特異結合，通過多種機制抑制或封閉目的基因的mRNA表達，使其

6、失去生物學功能。由于核酶所具有的獨特優(yōu)點，近10年來其研究進展十分迅速，特別是在基因治療領域報道甚多，而毒理學上的應用報道極少。 全文共分四個部分，主要研究內容如下：第一部分：hOGG1基因特異性錘頭狀核酶真核表達載體的構建和鑒定。應用計算機軟件模擬hOGG1的二級結構并輔助設計核酶，采用分子克隆手段將核酶基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)上，構建hOGG1特異性錘頭狀核酶真核表達載體pcDNA3.1(+)-RZ，并經(jīng)

7、酶切電泳和DNA測序鑒定。 第二部分：hOGG1低表達細胞株的建立及鑒定。運用真核細胞轉染的方法，將核酶的真核表達載體pcDNA3.1(+)-RZ經(jīng)FuGENE6介導轉染人的肺腺癌A549細胞；G418篩選，Neo基因的逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)擴增證實轉染成功；RT-PCR半定量檢測轉染細胞與未轉染細胞中hOGG1的表達水平，了解核酶對靶基因的抑制效果。 第三部分：hOGG1低表達細胞株的生物學特性鑒定。通過

8、觀察轉染細胞的形態(tài)、生長特性、細胞周期、細胞基礎凋亡率、細胞增殖指數(shù)、軟瓊脂克隆形成率及超氧化物歧化酶(SOD)的活力等，了解hOGG1低表達細胞的生物學特性，為應用奠定基礎。 第四部分：低表達細胞株在DNA氧化損傷與修復、藥物敏感性和放射敏感性研究中的初步應用。用彗星試驗比較重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、過氧化氫(H2O2)、抗腫瘤藥物阿霉素(ADM)和60Co-γ射線對轉染細胞(命名為A549-R細胞)和非轉染細胞(即A549

9、細胞)DNA氧化損傷與修復的差異；MTT試驗檢測兩種細胞在ADM和60Co-γ射線處理后的細胞存活率，流式細胞術檢測細胞周期、細胞凋亡和細胞增殖指數(shù)的變化，以了解hOGG1的低表達對細胞的藥物敏感性和放射敏感性的影響。主要研究結果如下： 1、應用計算機軟件模擬hOGG1的二級結構并輔助設計了60bp的核酶基因，采用分子克隆手段將核酶基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)上，經(jīng)酶切電泳和DNA序列測定證實核酶基因成功克隆到p

10、cDNA3.1(+)，從而構建了hOGG1特異性錘頭狀核酶真核表達載體pcDNA3.1(+)-RZ。 2、用FuGENE6轉染試劑將pcDNA3.1(+)-RZ轉染人肺腺癌A549細胞，通過G418篩選出陽性轉染的細胞克隆，RT-PCR擴增Neo基因證明質粒成功導入靶細胞。轉染了pcDNA3.1(+)-RZ的A549-R細胞hOGG1的mRNA表達下降，比未轉染的A549細胞降低61.5％，說明核酶基因在細胞內能夠轉錄出核酶，并

11、可有效抑制目的基因hOGG1的表達。 3、hOGG1低表達細胞株的生物學特性鑒定結果表明：在轉染初期轉染了核酶基因的A549-R細胞形態(tài)發(fā)生了一定的變化，但這種變化與hOGG1無關，且隨時間的延長，兩種細胞在形態(tài)上逐漸趨于一致。兩種細胞的生長特性(群體倍增時間、進入對數(shù)生長期時間等)、基礎凋亡率、細胞增殖指數(shù)和細胞周期各時相的分布均無明顯差異。軟瓊脂克隆形成試驗中轉染hOGG1核酶基因的A549-R細胞克隆形成數(shù)顯著低于未轉染的

12、A549細胞，而SOD活性則顯著高于未轉染細胞。 4、就損傷和修復相比，轉染細胞和非轉染細胞在修復方面的差異遠遠大于損傷的差異。對于損傷，四種受試物(K2Cr2O7、H2O2、ADM、60Co-γ射線)僅在個別濃度或個別指標表現(xiàn)出A549-R細胞的敏感性大于A549細胞；在修復方面，無論是修復的時間或/和修復的能力均表現(xiàn)出A549-R細胞的修復遠遠低于A549細胞。流式細胞術檢測結果顯示：ADM和60Co-γ射線均可引起細胞G0