受體酪氨酸激酶EphA1和PTK7在卵巢漿液性腫瘤中的表達研究.pdf

1、目的：
　　本研究采用免疫組織化學方法檢測EphA1和PTK7蛋白在14例正常輸卵管上皮、6例漿液性囊腺瘤、51例交界性漿液性卵巢腫瘤和97例卵巢漿液性癌組織中的表達水平。分析二者在卵巢漿液性癌中的表達情況與臨床病理特征及預后的關系，為卵巢漿液性癌的早期診斷、進展評估及預后判斷提供證據(jù)。并采用轉(zhuǎn)染方法研究EphA1過表達對卵巢漿液性癌細胞株生物學行為的影響。
　　方法：
　　1、細胞培養(yǎng)
　　細胞在含10％胎牛血

2、清的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2和95％空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
　　2、細胞免疫化學
　　將消化后的HO8910和A2780細胞懸浮液置于事先放有干凈蓋玻片的培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，當細胞達70％融合度時，撈片，冷丙酮固定15～20min。用3％ H2O2水封閉10min，分別滴加EphA1和PTK7一抗(1∶100)，4℃冰箱過夜，滴加二抗室溫孵育30min，DAB顯色2min，自來水終止顯色。蘇木素復染，

3、封片。
　　3、細胞轉(zhuǎn)染
　　細胞轉(zhuǎn)染采用陽離子脂質(zhì)體法，待A2780和H08910細胞達到40％～50％融合度時，按Invitrogen公司Lipofectamine2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。不加轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的空白對照組記作未轉(zhuǎn)染組(UTG)，加轉(zhuǎn)染試劑和空載質(zhì)粒的記作模擬組(MG)，加轉(zhuǎn)染試劑和EphA1質(zhì)粒的實驗組記作轉(zhuǎn)染組(TG)。用100μl DMEM無血清培養(yǎng)基分

4、別稀釋2μl轉(zhuǎn)染試劑及2μg空載質(zhì)?；駿phA1質(zhì)粒，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑分別混勻室溫靜置5min后，二者混合混勻室溫再靜置15min。去掉培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，PBS清洗2遍后，換為1800μl無血清DMEM培養(yǎng)基，并將混合物加入相應的組內(nèi)，其中UTG組再補200μl無血清DMEM培養(yǎng)基，搖勻。在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4h后，換為含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h進行熒光顯微鏡觀察和后續(xù)實驗。
　　4、RT-PCR
　　收集轉(zhuǎn)染48h后的

5、細胞，采取Trizol法提取總RNA，選擇OligdT引物，按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟，半定量反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板擴增EphA1和β-actin內(nèi)參。β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)基因庫mRNA序列（GenBank序列號:NM001101.3）設計其上游和下游引物分別為:5’-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3’和5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3’，PCR產(chǎn)物長度為4

6、16bp。根據(jù)基因庫mRNA序列(GenBank序列號:NM005232)設計EphA1上游引物和下游引物分別為:5’-ATCTTTGGGCTGCTGCTTGG-3’和5’-GCTTGTCCTCTCGATCCACATC-3’，PCR產(chǎn)物長度為127bp。反應條件為94℃3min，30×(98℃10s，55℃10s，72℃60s)，72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)攝片。
　　5、細胞增殖檢測MTT法

7、r>　　轉(zhuǎn)染48h時，將六孔板中的各組細胞消化后以100μl約1×104個細胞含量的密度種于5個復孔中(100μl/孔)，24h時按凱基MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(KGA311)說明書進行，加50μl1×MTT于各孔中，培養(yǎng)4h后棄去板中的培養(yǎng)液。加150μl DMSO于各孔中，振蕩使結(jié)晶物充分融解。使用酶標儀于490nm波長處檢測并記錄每個孔的OD值。
　　6、劃痕實驗
　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞傳代培養(yǎng)24h時，細胞融合度

8、達到60％以上時用20μl移液槍槍頭在六孔板均勻劃“一”字線。用PBS漂洗2遍后更換未含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，觀察并拍照。采用ImageJ軟件，在圖片上隨機劃6條直線，測量出細胞間相對距離，評價遷移情況。
　　7、免疫組織化學（Envision法）
　　石蠟切片經(jīng)60℃2h烤片后，脫蠟水化。采用檸檬酸鹽法進行抗原修復，3％H2O2去離子水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，分別加入EphA1(1:100)和PTK7(1:100

9、)置于4℃濕盒中孵育過夜或p53(1∶200)一抗，37℃1h。加入二抗，室溫放置30min后，DAB顯色，自來水終止顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。
　　綜合細胞染色程度和陽性細胞百分比進行評分。染色程度標準:基本不著色為0分;淡黃色為1分;黃色為2分;棕黃色為3分。陽性比例評分標準:陽性細胞數(shù)0％為0分;≤10％為1分;10％～50％為2分;50％～80％為3分;＞80％為4分。根據(jù)染色程度和陽性比例評分乘積，＞4分者為陽

10、性高表達，約≤4分者為陰性低表達。
　　8、統(tǒng)計分析
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行分析。所有計量資料用（平均值±標準差）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。應用x2檢驗或fisher確切概率法分析EphA1和PTK7蛋白的表達與臨床病理特征之間的關系。Kaplan-meier單因素生存分析其蛋白表達水平與患者生存時間的關系，篩選預后相關因素。采用COX比例風險回歸法，分析影響漿液性卵巢癌患者整體生存率的獨立預后因素。

11、采用Sperman相關性分析探討EphA1和PTK7與p53是否具有相關性。認為P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　EphA1對A2780和H08910細胞系生物學行為影響的研究:EphA1蛋白在A2780中的表達為弱陽性，在HO8910中的表達為陰性，RT-PCR顯示EphA1mRNA在A2780和H08910均陰性。EphA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)24h后，MTT法檢測HO8910和A2780各組細胞的增殖數(shù)量顯示轉(zhuǎn)

12、染組、模擬組、未轉(zhuǎn)染組OD值逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。24h劃痕實驗結(jié)果示HO8910轉(zhuǎn)染組細胞相對間距(1348.00±37.20)明顯高于未轉(zhuǎn)染組(101.83±21.40)和模擬組(707.00±54.71)(P＜0.001)。A2780轉(zhuǎn)染組細胞相對間距(1177.00±15.13)明顯高于未轉(zhuǎn)染組(159.83±42.52)和模擬組(463.00±44.99)(P＜0.001)。
　　EphA1在卵巢

13、漿液性腫瘤組織標本中的表達及意義:EphA1蛋白在正常輸卵管上皮組織和漿液性囊腺瘤中陽性表達率均為100％(14/14，6/6)，在卵巢交界性漿液性腫瘤中陽性表達率為92.15％(47/51)，EphA1蛋白在輸卵管正常上皮、卵巢漿液性囊腺瘤和交界性卵巢漿液性腫瘤中的表達無顯著差異(P＞0.05)。EphA1在卵巢漿液性癌中陽性表達率為43.30％(42/97)。EphA1在漿液性卵巢癌中低表達，與正常輸卵管上皮、良性漿液性卵巢腫瘤、交

14、界性漿液性卵巢腫瘤中表達相比均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。EphA1在卵巢交界性漿液性腫瘤中的表達與臨床分期、轉(zhuǎn)移情況（淋巴結(jié)和/或腹膜轉(zhuǎn)移）、發(fā)生部位和年齡無關（P＞0.05）。EphA1蛋白在漿液性卵巢癌組織中的表達與臨床分期、WHO分級和二級組織學(MDACC)分級相關（P=0.004，P＜0.001，P=0.008），與轉(zhuǎn)移情況、腫瘤部位、腫瘤最大徑和年齡無關（P＞0.05）。
　　PTK7蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表

15、達及意義:PTK7蛋白在卵巢癌細胞株HO8910及A2780中呈陰性表達。PTK7蛋白在92.86％(13/14)正常輸卵管上皮、83.33％(5/6)卵巢漿液性囊腺瘤、45.10％(23/51)交界性漿液性卵巢腫瘤和28.87％(28/97)漿液性卵巢癌中陽性表達。正常輸卵管上皮與卵巢漿液性囊腺瘤、卵巢漿液性囊腺瘤與交界性漿液性腫瘤之間的PTK7表達無顯著差異(P=0.521，P=0.102)。漿液性卵巢癌與正常輸卵管上皮、卵巢漿液性

16、囊腺瘤以及交界性漿液性腫瘤之間PTK7表達存在顯著差異(P＜0.001，P=0.012，P=0.048)。PTK7在交界性漿液性卵巢腫瘤中的表達與臨床分期和轉(zhuǎn)移情況（淋巴結(jié)和/或腹膜轉(zhuǎn)移）有關(P=0.038，P=0.038)，與發(fā)生部位和年齡無關(P=0.088，P=0.896)。PTK7在卵巢漿液癌中的表達與臨床分期(P=0.034)、WHO分級(P=0.004)、MDACC病理分級(P＜0.001)和轉(zhuǎn)移情況(P=0.025）有關

17、，與發(fā)生部位(P=0.326)、腫瘤直徑(P=0.298)和年齡(P=0.584）無關。
　　結(jié)論:
　　EphA1在輸卵管正常上皮、良性及交界性漿液性卵巢腫瘤表達無差別，均比漿液性癌中的表達高。PTK7蛋白在輸卵管正常上皮、良性、交界性、惡性漿液性卵巢腫瘤中的表達呈逐步下調(diào)趨勢。EphA1和PTK7蛋白的低表達均與漿液性卵巢癌較晚臨床分期、高組織分級、預后差正相關，提示二者參與卵巢漿液性癌的發(fā)生發(fā)展，可能成為卵巢漿液性腫瘤