FGFsFGFR3與1,25(OH)2D3VDR信號通路的交互作用及其在軟骨發(fā)育中的作用及意義研究.pdf

1、骨骼是人體重要的組織器官,是機體機械運動的基礎(chǔ)。近年的研究發(fā)現(xiàn),骨骼系統(tǒng)參與了生理及病理條件下機體代謝、內(nèi)分泌和造血功能的調(diào)控。良好的骨骼發(fā)育是機體健康的基礎(chǔ),骨骼發(fā)育具體機制的深入探索對尋找骨骼疾病新的治療措施與方案具有重要意義。骨骼發(fā)育包括軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨兩種途徑,是一個高度有序、受到多種因素共同調(diào)控的過程。軟骨內(nèi)成骨是哺乳動物骨骼形成的主要途徑。成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factors,FGFs)

2、及其受體成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptors,FGFRs)在調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)成骨中發(fā)揮重要的作用。FGFR3屬于酪氨酸激酶受體家族,其基因突變與多種骨骼發(fā)育性疾病密切相關(guān)。
　　通過對FGFR3基因工程小鼠的深入研究表明,FGFR3在骨骼發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。模擬人軟骨發(fā)育不全的 FGFR3功能增強型(gain-of function)點突變小鼠模型(FGFR3G369C/+小鼠

3、,即ACH小鼠)表現(xiàn)為身材短小,長骨生長板結(jié)構(gòu)紊亂,軟骨細胞增殖速度減慢。ACH小鼠軟骨細胞的分化受到抑制,表現(xiàn)為肥大軟骨細胞數(shù)量減少,肥大帶變窄,伴 X型膠原表達明顯降低。FGFR3全身敲除小鼠則出現(xiàn)與之相反的表型,其長骨過度生長,出現(xiàn)脊柱側(cè)彎,長骨生長板變寬,肥大軟骨細胞數(shù)量顯著增加,伴隨X型膠原表達增高。目前觀點認為FGFs與受體FGFR3結(jié)合后能夠激活下游STAT1/p21、MAPK、PLC-γ和 PI3K等信號通路,此外,還能

4、夠與IHH/PTHrP環(huán)路等其他重要信號通路相互協(xié)調(diào),對軟骨內(nèi)成骨過程起負性調(diào)節(jié)作用。然而目前對于由 FGFR3突變所致的骨骼發(fā)育性疾病尚無有效的治療措施,科學家們針對 FGFR3及相關(guān)的信號通路所采取的干預(yù)措施并不能完全緩解由 FGFR3異常激活所致的骨骼發(fā)育異常。這提示FGFR3激活后可能通過其他的機制參與了對骨骼發(fā)育過程的調(diào)控。
　　除了 FGFs/FGFR3外,許多重要的信號通路也參與了骨骼發(fā)育的調(diào)控,如Wnt/βcate

5、nin、IHH/ PTHrP、1,25(OH)2D3/VDR等。1,25(OH)2D3/VDR信號通路在哺乳動物鈣、磷代謝及骨穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用。1,25(OH)2D3與FGF23和PTH一起構(gòu)成調(diào)節(jié)環(huán)路,參與對鈣磷代謝的精確調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn),1,25(OH)2D3/VDR信號通路同樣參與了軟骨發(fā)育過程的調(diào)控。在體外試驗中,我們以及其他課題組的結(jié)果均證實1,25(OH)2D3對軟骨細胞的增殖有明顯的抑制作用,而且大劑量應(yīng)用1,

6、25(OH)2D3能夠抑制小鼠生長。VDR全身敲除小鼠(VDR-/-)在發(fā)育早期階段就出現(xiàn)長骨生長板肥大帶異常增寬,軟骨細胞排列紊亂;軟骨細胞中特異性敲除(ColII-cre)VDR后,X型膠原表達明顯降低。這些實驗結(jié)果提示1,25(OH)2D3/VDR信號通路在軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。重要的是,VDR敲除小鼠的矮小表型與FGFR3功能增強型小鼠的侏儒表型相似,提示 FGFs/FGFR3與1,25(OH)2D3/VDR通路之

7、間可能存在交互作用(Crosstalk)。前期研究顯示,多個蛋白可以通過與 VDR蛋白直接相互作用,調(diào)控1,25(OH)2D3/VDR通路的活性與功能。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),大部分與VDR有直接作用的蛋白質(zhì)分子都含有一段保守序列,即LXXLL序列。FGFR3胞內(nèi)段第705位氨基酸殘基開始即為LFKLL,提示FGFR3有可能與VDR直接結(jié)合,通過調(diào)控1,25(OH)2D3/VDR通路的活性與功能,進而參與軟骨內(nèi)成骨的調(diào)節(jié),但目前缺乏相關(guān)的實驗證據(jù)

8、。
　　本研究中,我們利用組織形態(tài)學、細胞生物學、分子生物學等相關(guān)的技術(shù)與方法,研究FGFR3與VDR受體之間的交互作用及其機制,并利用體外組織培養(yǎng)模型初步探討FGFs/FGFR3與VDR信號通路的交互作用在軟骨內(nèi)成骨中的作用及意義。
　　主要實驗方法:
　　1. FGFR3與VDR受體分子間直接相互作用的研究
　　采用細胞免疫熒光、免疫共沉淀等方法研究FGFR3與VDR受體之間的相互作用。
　　1.1、細

9、胞免疫熒光實驗檢測FGFR3與VDR的共定位。
　　1.2、YFP-PCA熒光實驗檢測FGFR3與VDR的共定位。
　　1.3、檢測生理條件下VDR與FGFR3內(nèi)源性相互作用。
　　1.4、293T細胞中FGFR3與VDR受體間相互作用的檢測。
　　1.5、通過轉(zhuǎn)染不同激活形式的FGFR3表達載體,檢測FGFR3的激活形式對相互作用的影響。
　　2. FGFs/FGFR3信號通路對1,25(OH)2D3/V

10、DR信號通路的影響
　　2.1、免疫組化檢測FGFR3基因突變小鼠長骨生長板VDR受體蛋白水平的變化
　　2.2、檢測FGFR3基因突變對原代軟骨細胞內(nèi)VDR蛋白水平的影響。
　　2.3、檢測FGFR3通路的活性對VDR蛋白水平的影響(通過加入FGFR3的配體、抑制劑進行干預(yù))。
　　2.4、外源FGFR3對胞內(nèi)VDR蛋白水平的影響。
　　2.5、定量PCR檢測FGFR3基因敲除對VDR轉(zhuǎn)錄水平的影響。

11、r>　　2.6、定量PCR檢測RNAi干擾FGFR3后對VDR轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　3.1、25(OH)2D3對FGFs/FGFR3信號通路的影響
　　3.1、通過在NIH3T3細胞中轉(zhuǎn)染ERK報告基因,觀察1,25(OH)2D3對ERK1/2轉(zhuǎn)錄的影響。
　　3.2、檢測1,25(OH)2D3對軟骨細胞FGFR3信號激活后磷酸化ERK1/2蛋白水平的影響。
　　4. VDR與FGFR3受體間的相互作用對軟骨發(fā)育

12、的影響
　　4.1、 MTT實驗檢測1,25(OH)2D3對軟骨細胞增殖能力的影響。
　　4.2、利用體外組織培養(yǎng)模型觀察1,25(OH)2D3/VDR信號通路之間的串話作用對小鼠跖骨生長的影響。
　　主要實驗結(jié)果
　　1. FGFR3與VDR受體間存在相互作用
　　本課題通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn) FGFR3與 VDR存在共定位,然后進一步利用YFP-PCA實驗證實FGFR3與VDR在細胞內(nèi)有共定位,二者共同定

13、位于細胞質(zhì)靠近核的區(qū)域;通過免疫共沉淀實驗證實在不同細胞系內(nèi)FGFR3與VDR受體間均存在相互作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)FGFR3與VDR之間的相互作用依賴于FGFR3酪氨酸激酶活性, VDR不能被失活型突變的FGFR3特異性的沉淀。
　　2. FGFs/FGFR3信號通路對1,25(OH)2D3/VDR信號通路的影響
　　我們通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)ACH小鼠脛骨生長板處VDR表達量降低,而FGFR3敲除后小鼠脛骨生長板處VDR表達

14、顯著增高。Western Blotting實驗證實原代軟骨細胞內(nèi)FGFR3激活型突變能降低VDR蛋白水平,而敲除FGFR3(他莫昔芬誘導)后VDR蛋白量明顯升高。通過加入FGFR3的配體FGF18、酪氨酸激酶抑制劑PD173074,從配體水平干預(yù)原代軟骨細胞內(nèi)FGFR3的活性狀態(tài),證實FGFR3對VDR蛋白水平的下調(diào)作用與酪氨酸激酶活性有關(guān),這提示在生理條件下未發(fā)生突變的 FGFR3受體也能通過自身活性的變化對VDR蛋白水平起調(diào)節(jié)作用;

15、此外,通過轉(zhuǎn)染不同劑量的野生型FGFR3表達載體,我們發(fā)現(xiàn)FGFR3對VDR蛋白水平的下調(diào)作用存在劑量依賴效應(yīng)。定量PCR結(jié)果顯示FGFR3不影響VDR的轉(zhuǎn)錄水平,提示FGFR3在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控VDR蛋白水平,并調(diào)控VDR相關(guān)信號通路。
　　3.1,25(OH)2D3對FGFs/FGFR3信號通路的影響
　　雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示1,25(OH)2D3有效抑制由FGFR3受體活化而引起的下游信號通路的激活。此外,We

16、stern Blotting證實1,25(OH)2D3能夠顯著降低磷酸化ERK1/2的蛋白水平,從而對FGFs/FGFR3信號通路起負性調(diào)節(jié)作用。
　　4. VDR與FGFR3受體間的相互作用對軟骨內(nèi)成骨的影響
　　我們通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3能夠抑制ATDC5細胞的增殖能力,這進一步證實VDR信號通路可能參與了對軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控。此外,利用體外跖骨培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)軟骨內(nèi)成骨的過程,發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3

17、可有效緩解由FGFR3激活型突變引起的跖骨生長速度的延緩。
　　主要結(jié)論:
　　1. FGFR3與VDR受體間存在相互作用。
　　2. FGFs/FGFR3通過與1,25(OH)2D3/VDR信號通路的交互作用,降低VDR的蛋白水平;1,25(OH)2D3能抑制FGFR3下游ERK1/2的磷酸化水平,從而相互產(chǎn)生負性調(diào)控作用。
　　3.體外培養(yǎng)模型顯示1,25(OH)2D3可緩解FGFR3功能增強所致的軟骨生長抑