聯(lián)合應(yīng)用羅格列酮與維甲酸對HCT-15細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究.pdf

1、研究背景和目的：過氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是屬于核激素受體(nuclear hormone receptor)超家族中的一員，由英國科學(xué)家Issemann和Green于1990年首先在老鼠的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。它在調(diào)控細(xì)胞的生長、分化及凋亡等方面起重要作用。目前己知有三種亞型，即PPARa、PPARb、PPARγ。他們由不同的基因編碼，氨基

2、酸序列高度相似，特別是在DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域。其中PPARγ是被研究的最多的一種亞型。PPARγ的生物學(xué)功能復(fù)雜多樣，近年來PPARγ受體激動(dòng)劑的抗腫瘤作用受到腫瘤學(xué)術(shù)界的重視，Mueller等驗(yàn)證了PPARγ配體對前列腺的生長抑制效應(yīng)，表明激活PPARγ是一種很有潛力的治療腫瘤的方法。Nagamine發(fā)現(xiàn)，羅格列酮能增加人胃癌細(xì)胞系MKN-28，45和74凋亡細(xì)胞數(shù)。越來越多的證據(jù)表明，PPARγ受體激動(dòng)劑具有顯著的抗腫瘤作用，其

3、作用機(jī)制涉及：1)阻滯細(xì)胞周期；2)促進(jìn)細(xì)胞分化；3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。
　　 維甲酸(RA)又稱視黃酸或維生素A酸，是維生素A的衍生物。機(jī)體內(nèi)一定濃度的維甲酸可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、成熟，是機(jī)體正常生長發(fā)育和各種生理活動(dòng)必不可少的重要因子。同時(shí)，維甲酸在惡性腫瘤的發(fā)生與治療方面也有著重要的作用。維甲酸包括多種同分異構(gòu)體，其中全反式構(gòu)型最為穩(wěn)定和常用。全反式維甲酸(ATRA)是用于臨床腫瘤化療治療及預(yù)防較為成熟的維甲類藥物之一，能

4、夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的惡性生長，是一種常用的誘導(dǎo)分化劑。目前已知PPAR可與維甲酸X受休(retinoid X receptor.RXR)結(jié)合形成異二聚體(PPAR/RXR).再結(jié)合于特定的DNA序列——過氧化物體增殖反應(yīng)元件(peroxisome proliferators response element，PPRE)，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。Elstner在體外和移植于裸鼠體內(nèi)的乳腺腫瘤中，發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸(all-transretin

5、oic acid，ATRA)協(xié)同PPARγ配體抑制癌腫瘤細(xì)胞生長，bc1-2水平降低；因此提示使用PPARγ激動(dòng)劑和維甲酸能激活PPARγ/RXR(retinoid x receptor)異二聚體可能是治療多種腫瘤的有效方法。目前，針對惡性腫瘤的靶向藥物的聯(lián)合應(yīng)用，是預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的趨勢。本實(shí)驗(yàn)我們通過研究高選擇性的維甲酸受體配基全反式維甲酸(ATRA)和PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(ROS)聯(lián)合應(yīng)用對人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-15增殖和

6、凋亡的影響，觀察聯(lián)合用藥和單獨(dú)用藥之間的差異，并且進(jìn)一步探討其作用的分子機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分為：空白對照組(未加藥)；溶酶對照組(加入含等體積的DMSO的培養(yǎng)液)；實(shí)驗(yàn)組(ROS單藥組：6.25、12.5、25、50umo1/L；ATRA單藥組：2umo1/L；ROS與ATRA聯(lián)合用藥組：ROS各濃度+2umo1/LATRA)。在分別或聯(lián)合應(yīng)用不同濃度、不同時(shí)間的ROS、ATRA干預(yù)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-15后，噻唑藍(lán)(

7、MTT)法檢測藥物對細(xì)胞生長的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞生長周期的變化；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測干預(yù)前后細(xì)胞表達(dá)COX-2，MMP-7，TIMP-1蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：單獨(dú)應(yīng)用ROS可抑制HCT-15細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，并呈濃度-時(shí)間依賴性，與ATRA聯(lián)合應(yīng)用則有明顯的協(xié)同作用(q＞1.15)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：單獨(dú)應(yīng)用ROS和ATRA可導(dǎo)致GO/G1期細(xì)胞比例上升，而S期比例下降明顯，誘導(dǎo)HCT-

8、15細(xì)胞凋亡(P＜0.05)；而聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞G1期的阻滯作用更強(qiáng)(P＜0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：COX-2，MMP-7，TIMP-1在對照組人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15中陽性表達(dá)率分別為66.79％、73.21％、64.08％，聯(lián)合應(yīng)用后三種蛋白的表達(dá)率為19.33％，20.58％，13.13％，二者有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：羅格列酮和維甲酸可降低HCT-15細(xì)胞中COX-2，MMP-7，TIMP