維甲酸誘導(dǎo)腭裂形成時空變化中細(xì)胞增殖與凋亡的作用研究.pdf

1、背景：腭裂是一種常見的先天性畸形，因其影響因素十分復(fù)雜，發(fā)生機(jī)制目前仍未明確。胚胎時期細(xì)胞增殖、分化形成組織器官的原基，在其過程中也存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，是組織進(jìn)行自我更新、決定新生細(xì)胞數(shù)量及速度的重要因素。腭的發(fā)育中常由于各種因素影響腭突的正常發(fā)育過程，導(dǎo)致腭發(fā)育畸形。近年來一些研究表明，腭中嵴上皮(MEE)細(xì)胞和腭胚間充質(zhì)(EPM)細(xì)胞的增殖和凋亡對腭的正常發(fā)育具有重要作用，與腭裂的形成密切相關(guān)。在已知能誘發(fā)腭裂的致畸物質(zhì)中，維甲酸(r

2、etinoic acid，RA)是致畸作用比較顯著的一種，有文獻(xiàn)表明在胚胎畸形發(fā)生中，RA可能具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。腭突生長的不同時期攝入RA所誘導(dǎo)的腭裂形式不同，但其機(jī)制尚不明確。BrdU能特異標(biāo)識S期細(xì)胞，是反映細(xì)胞增殖及跟蹤監(jiān)測增殖細(xì)胞的理想指標(biāo)。TUNEL是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。 本實驗應(yīng)用穩(wěn)定的腭裂畸形

3、的動物模型體系，分別在腭突發(fā)生的不同時期給與小鼠RA，用BrdU標(biāo)識腭突增殖細(xì)胞，TUNEL標(biāo)識凋亡細(xì)胞，通過研究MEE細(xì)胞和EPM細(xì)胞在腭突融合期的增殖和凋亡的改變，來探索RA作用于腭突發(fā)生的不同時期所誘導(dǎo)的腭裂的發(fā)生機(jī)制。 目的：本實驗通過研究MEE細(xì)胞和EPM細(xì)胞在腭突融合期增殖和凋亡的改變，來探索RA作用于腭突發(fā)生的不同時期所誘導(dǎo)的腭裂的發(fā)生機(jī)制。 方法：選取10周齡左右SPF級C57BL/6J．近交系小鼠，于第

4、一天晚8時按雌雄比2:1合籠交配。第二天上午8時檢測陰栓，將陰栓陽性的雌鼠記為妊娠0天(gestation day 0，GDO)，共得到孕鼠32只，將這些孕鼠隨機(jī)分為三組：第一組為對照組，共8只；第二組為10天給藥組，共16只；第三組為12天給藥組共8只。10天給藥組和12天給藥組的孕鼠分別在GD10上午10時、GD12上午10時按100mg/kg體重灌胃RA；對照組灌胃植物油0.2m1。全部孕鼠于GD15上午10時處死，處死前20分鐘

5、均按100mg/kg體重腹腔注射BrdU。BrdU和TUNEL免疫組化染色方法標(biāo)識腭突融合期即小鼠胚胎15天(Embryonic day 15，E15)實驗組和對照組腭突中增殖和凋亡細(xì)胞的表達(dá)和分布變化，然后用標(biāo)識指數(shù)(BI和TI)分析。 結(jié)果：1、在腭突融合期即E15，10天給藥組小鼠EPM細(xì)胞中BrdU陽性細(xì)胞率在冠狀面和水平面切片都明顯低于對照組(P<0.01)；12天給藥組和對照組小鼠EPM細(xì)胞中BrdU陽性細(xì)胞率在冠狀

6、面和水平面無顯著性差異(P>0.05)；2、10天給藥組小鼠MEE細(xì)胞中BrdU陽性細(xì)胞率在水平面明顯低于對照組(P<0.05)；12天給藥組與對照組小鼠MEE細(xì)胞中BrdU陽性細(xì)胞率無顯著性差異(P>0.05)；3、12天給藥組與對照組小鼠EPM細(xì)胞中未見TUNEL陽性細(xì)胞，10天給藥組小鼠EPM細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞呈散在分布(P<0.01)；對照組與12天給藥組小鼠EPM細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞率無顯著性差異(P>0.05)；4

7、、10天給藥組小鼠MEE細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞率明顯低于對照組(P<0.01)；12天給藥組與對照組小鼠MEE細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞率無顯著性差異(P>0.0 5)。 結(jié)論：1、RA作用于腭突發(fā)生不同時期誘導(dǎo)的腭裂形式不同：作用于腭突發(fā)生前期，雙側(cè)腭突形態(tài)發(fā)育障礙、接觸失敗導(dǎo)致腭裂；作用于腭突垂直生長期，雙側(cè)腭突形態(tài)發(fā)育正常，發(fā)生接觸但融合失敗。2、RA作用于腭突發(fā)生前期，誘導(dǎo)EPM細(xì)胞增殖抑制、凋亡過度，最終導(dǎo)致雙側(cè)腭突形