葉酸預(yù)防維甲酸腭裂模型的研究.pdf

1、腭裂是人類常見的先天性畸形之一，其發(fā)病原因較為復(fù)雜，目前多傾向于由遺傳與環(huán)境因素的共同作用所致，且與多個(gè)基因有關(guān)，是一種多基因遺傳病。其發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞的增殖與凋亡，多種細(xì)胞因子及其受體表達(dá)的改變等有關(guān)。但腭部發(fā)育及腭裂形成過(guò)程中相關(guān)基因的確切作用和其表達(dá)的變化尚不明確。因此，研究腭裂的發(fā)病機(jī)理及探尋有效的防治措施顯得尤為重要。 全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）是維生素A的代謝物，生理水

2、平的維甲酸能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，與正常的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)；而過(guò)量的維甲酸有明顯的毒副作用，可以誘導(dǎo)多種生物的組織器官形成畸形。ATRA誘導(dǎo)腭裂形成的原因可能與調(diào)控腭間充質(zhì)細(xì)胞凋亡，干擾上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及中嵴上皮的消退等有關(guān)，但其確切的作用機(jī)制仍有待研究。 葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是一種水溶性B族維生素，由喋啶核、對(duì)氨苯甲酸及谷氨酸三部分組成，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、修復(fù)和宿主防御等方面扮演重要角色，是DNA和RNA合成過(guò)

3、程中需要的重要物質(zhì)。葉酸缺乏影響細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致包括腭裂在內(nèi)的多種先天性畸形發(fā)生。作為一種預(yù)防腭裂的有效藥物，葉酸在臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但其作用機(jī)理仍不明確。 本研究建立維甲酸誘導(dǎo)腭裂模型，應(yīng)用腭器官體外培養(yǎng)法，模擬腭板的生長(zhǎng)及融合過(guò)程，并檢測(cè)維甲酸受體的時(shí)空表達(dá)變化，闡明ATRA誘導(dǎo)腭裂的分子機(jī)制。葉酸是一種腭裂預(yù)防的常用藥物，研究其預(yù)防ATRA誘導(dǎo)腭裂的作用機(jī)制，可為減少腭裂的發(fā)生提供有益的參考。 目的：

4、 1．建立維甲酸腭裂模型，應(yīng)用腭器官體外培養(yǎng)法，觀察不同條件下腭板的生長(zhǎng)及融合情況。 2．檢測(cè)維甲酸受體RARα、RARβ及RXRα在胚胎腭中的時(shí)空表達(dá)變化，闡明ATRA誘導(dǎo)腭裂的分子機(jī)制。 3．研究葉酸預(yù)防ATRA誘導(dǎo)腭裂的作用機(jī)制，為腭裂預(yù)防提供有益的參考。 研究方法： 1．腭器官體外培養(yǎng)模型選取10周齡左右SPF級(jí)C57BL/6J近交系小鼠，于第一天晚8時(shí)按雌雄比1∶1合籠交配，第二天上午8時(shí)檢測(cè)

5、陰栓，將陰栓陽(yáng)性的雌鼠記為妊娠0天（gestation0 day，GD0）。孕鼠于GD14處死，將胎鼠從母鼠子宮內(nèi)取出，在無(wú)菌條件下解剖出胎鼠的雙側(cè)腭板，放入盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的器官培養(yǎng)皿中。將ATRA溶于無(wú)水乙醇，葉酸溶于NaOH，隨DMEM/F12培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿中，使ATRA終濃度分別為1μM、10μM，葉酸的終濃度為0．1mM。實(shí)驗(yàn)分6組，即對(duì)照組、ATRA1μM組、ATRA10μM組、Folic acid組、ATRA1

6、0μM+FA（0h）組、ATRA10μM+FA（24h）組，每組有8個(gè)樣本。將培養(yǎng)皿置于含5％CO2、37℃恒溫箱中，分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后取出腭板，吖啶橙染色，鏡下觀察各組腭板在不同時(shí)間點(diǎn)的組織學(xué)形態(tài)。然后將腭板用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色后觀察。 2．維甲酸誘導(dǎo)腭裂的機(jī)理及葉酸的預(yù)防作用研究免疫組化染色法檢測(cè)各組腭板中維甲酸受體RARα、RARpβ及RXRα的時(shí)空表達(dá)變化，從而推斷出維甲酸誘導(dǎo)

7、腭裂的機(jī)理及葉酸預(yù)防腭裂可能的原因。 結(jié)果： 1．本實(shí)驗(yàn)成功地建立維甲酸誘導(dǎo)腭裂模型，運(yùn)用腭器官體外培養(yǎng)法，觀察不同條件下腭板的組織學(xué)形態(tài)?？梢娕囵B(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，對(duì)照組腭板的融合數(shù)分別為4、7、8，而1μM及10μM ATRA組未見腭板融合，差異有顯著性（P<0．05），說(shuō)明過(guò)量的ATRA具有明顯的致畸性，能夠誘導(dǎo)腭裂形成。ATRA10μM+FA（0h）組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腭板的融合數(shù)為4、5、6，與對(duì)照組和葉

8、酸組相近，而與ATRA組差異明顯（P<0．05），表明葉酸能夠預(yù)防ATRA誘導(dǎo)的腭裂。ATRA10μM+FA（24h）組培養(yǎng)48小時(shí)后腭板的融合數(shù)僅為1，與對(duì)照組差異顯著（P<0．05），提示葉酸盡管可以有效預(yù)防ATRA誘導(dǎo)的腭裂，但卻沒有治療的功效。 2．應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)維甲酸受體的變化發(fā)現(xiàn)：RARα、RARβ及RXRα在胚鼠腭中呈胞核表達(dá)，其表達(dá)的變化隨腭部的發(fā)育階段和腭突的不同部位而有差異。ATRA誘導(dǎo)RARα的表達(dá)作用

9、不明顯，隨ATRA濃度的升高，RARα的表達(dá)略有增強(qiáng)，主要見于腭間充質(zhì)細(xì)胞。ATRA可明顯上調(diào)RARβ的表達(dá)，且與部位、時(shí)間及ATRA濃度有關(guān)。ATRA濃度越高，誘導(dǎo)RARβ表達(dá)的作用越強(qiáng)，且多見于腭板融合期的間充質(zhì)和口腔側(cè)上皮。ATRA在腭板融合期可以明顯地抑制RXRα在間充質(zhì)中的表達(dá)，并稍增強(qiáng)其在上皮中表達(dá)。早期加入葉酸可以拮抗ATRA的作用，使維甲酸受體RARα、RARβ及RXRα在腭部的表達(dá)情況接近于對(duì)照組。但如果在ATRA作用

10、24小時(shí)后再加入葉酸，則無(wú)這種效果，可見其維甲酸受體表達(dá)情況與對(duì)照組差異明顯，而與ATRA組基本相同。 結(jié)論： 1．本研究成功建立維甲酸誘導(dǎo)腭裂模型。通過(guò)腭板器官體外培養(yǎng)法，基本可以重復(fù)體內(nèi)雙側(cè)腭突接觸融合過(guò)程。并通過(guò)向腭板培養(yǎng)基中加入不同濃度ATRA，建立維甲酸誘導(dǎo)腭裂模型，為研究腭裂的發(fā)病機(jī)理提供了可靠的手段。 2．成功運(yùn)用葉酸預(yù)防ATRA誘導(dǎo)的腭裂。運(yùn)用葉酸時(shí)需注意時(shí)間和劑量，只有早期應(yīng)用適量的葉酸，才能有