產(chǎn)前應(yīng)激大鼠子耳蝸BDNF、NSE改變及氟西汀干預(yù)作用的試驗(yàn)研究.pdf

1、越來越多的研究已經(jīng)證實(shí)：生命早期的環(huán)境對胎兒、新生兒及成年個(gè)體的發(fā)育具有深遠(yuǎn)的影響。隨著社會競爭的加劇，來自家庭、工作、環(huán)境的壓力影響著每一個(gè)人，孕婦作為一特殊的群體，受到人們的廣泛重視。孕期應(yīng)激主要是抑制性應(yīng)激，以焦慮和抑郁最常見，其發(fā)生率可達(dá)16.5％。人們在認(rèn)識到產(chǎn)前應(yīng)激能夠影響胎兒大腦生長發(fā)育、與子代某些生理缺陷相關(guān)，可造成子代遠(yuǎn)期功能損害的同時(shí)，也注意到產(chǎn)前應(yīng)激對子代的聽覺功能有影響，但其具體機(jī)制不詳。
　　 近年來，

2、國內(nèi)外均有報(bào)道長期慢性應(yīng)激與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)下調(diào)相關(guān)，而BDNF作為應(yīng)激保護(hù)因子在應(yīng)激中發(fā)揮了重要的作用，但目前尚未見產(chǎn)前應(yīng)激中BDNF改變導(dǎo)致子代聽覺神經(jīng)系統(tǒng)變化的研究。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì)，是反映神經(jīng)細(xì)胞損害的最敏感指標(biāo)之一，可作為神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物，但產(chǎn)前應(yīng)激中N

3、SE是否發(fā)生了改變，這種改變是否與子代聽覺功能受損有關(guān)，目前尚未見報(bào)道。
　　 同時(shí)，有研究表明在應(yīng)激所致疾病的有關(guān)報(bào)道中，抗抑郁藥氟西汀能夠通過增加BDNF的表達(dá)，對這些疾病具有治療和保護(hù)作用。但是，氟西汀用于治療產(chǎn)前應(yīng)激引起的子代聽力損傷國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 以往的束縛應(yīng)激模型都是將應(yīng)激的時(shí)間固定在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，這樣動物易產(chǎn)生慣性，本實(shí)驗(yàn)在原有束縛應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，將應(yīng)激的時(shí)間隨機(jī)分配，這樣使動物模型更加

4、完善。
　　 目的
　　 本實(shí)驗(yàn)所要完成的部分即為建立在改進(jìn)后的產(chǎn)前束縛應(yīng)激大鼠動物模型的基礎(chǔ)上，用氟西汀進(jìn)行干預(yù)，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察子代耳蝸核組織BDNF和NSE的變化，觀察產(chǎn)前束縛應(yīng)激動物模型建立的成功與否，進(jìn)一步探索產(chǎn)前應(yīng)激對子代耳蝸核損傷的內(nèi)在機(jī)制，以及氟西汀在減輕這一損傷時(shí)所產(chǎn)生的部分作用機(jī)理。這不僅有利于我們?yōu)樵挟a(chǎn)期社會心理保健提供理論依據(jù)，而且對于孕產(chǎn)期應(yīng)激性疾病的預(yù)防和治療具有重要的意義。
　

5、　 材料與方法
　　 1 SD成年雌性大鼠36只，體重在210～250g之間。成年雄性大鼠10只，體重在270～320g之間。雌雄大鼠合籠后，以動情期發(fā)現(xiàn)精子滿視野為妊娠第0天。雌鼠隨機(jī)分為6組，即空白對照組(A組，n=6)、產(chǎn)前應(yīng)激組(B組，n=6)、產(chǎn)前應(yīng)激+高劑量氟西汀干預(yù)組(C組，n=6，氟西汀劑量1.2mg/kg)、產(chǎn)前應(yīng)激+中劑量氟西汀干預(yù)組(D組，n=6，氟西汀劑量0.8mg/kg)、產(chǎn)前應(yīng)激+低劑量氟西汀干預(yù)組

6、(E組，n=6，氟西汀劑量0.4mg/kg)、產(chǎn)前應(yīng)激+生理鹽水對照組(F組，n=6)，每組各6只。A組為正常妊娠分娩，不給予任何處理。產(chǎn)前應(yīng)激采用束縛應(yīng)激模型，在妊娠第1-14天給予束縛應(yīng)激，3次/天，45分鐘/次。自造模第1天起，各用藥組(C、D、E組)每日在第一次束縛應(yīng)激前1小時(shí)分別灌服氟西汀，灌胃容積為10ml，F(xiàn)組則灌服等體積的生理鹽水。每組孕鼠所產(chǎn)仔鼠按窩別每窩隨機(jī)取1-2只，每組10只，并按照母鼠相對應(yīng)的分組分為OA、OB

7、、OC、OD、OE、OF組。
　　 2各組分別觀察母鼠孕期液體消耗量。
　　 3各組仔鼠(14日齡)分別于處死前測試聽性腦干反應(yīng)(ABR)，記錄ABR反應(yīng)閾，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期及Ⅰ～Ⅱ、Ⅱ～Ⅲ、Ⅰ～Ⅲ波間期。
　　 4各組仔鼠在ABR測試完畢后處死，取腦組織，選取特定平面即耳蝸核進(jìn)行切片，共取四套，一套行HE染色，一套行BDNF免疫組織化學(xué)染色，一套行NSE免疫組織化學(xué)染色，另一套作為陰性對照。
　　 5

8、應(yīng)用德國Leica圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，Biosens Digital ImagingSystems V1.6軟件(上海山富科學(xué)儀器有限公司)系統(tǒng)分析各組仔鼠耳蝸核BDNF和NSE免疫組織化學(xué)染色的平均光密度值。
　　 6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析ANOVA檢驗(yàn)，兩組之間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果：

9、
　　 1產(chǎn)前應(yīng)激組孕鼠14天應(yīng)激結(jié)束后，糖水消耗量及糖水偏愛度均明顯降低，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；氟西汀干預(yù)組孕鼠糖水消耗量及偏愛度均有提高，其中以氟西汀1.2mg/kg組提高最明顯，與產(chǎn)前應(yīng)激生理鹽水對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 2產(chǎn)前應(yīng)激組仔鼠ABR反應(yīng)閾升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期及Ⅰ～Ⅱ、Ⅱ～Ⅲ、Ⅰ～Ⅲ波間期明顯延長，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

10、1)；氟西汀1.2mg/kg組仔鼠ABR反應(yīng)閾明顯降低，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期及Ⅰ～Ⅱ、Ⅱ～Ⅲ、Ⅰ～Ⅲ波間期均縮短，與產(chǎn)前應(yīng)激生理鹽水對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3產(chǎn)前應(yīng)激組仔鼠耳蝸核HE染色可見神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞腫脹，胞漿和胞核濃縮，尼氏體減少；氟西汀1.2mg/kg干預(yù)組仔鼠耳蝸核HE染色見神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞發(fā)育正常，各亞核細(xì)胞排列整齊，極少數(shù)胞漿和胞核出現(xiàn)皺縮和空泡樣變。
　　 4光

11、鏡下見耳蝸核組織BDNF免疫反應(yīng)物呈棕黃色，NSE免疫反應(yīng)物呈棕褐色，產(chǎn)前應(yīng)激組仔鼠耳蝸核BDNF和NSE免疫組化平均光密度值明顯低于空白對照組，即BDNF和NSE表達(dá)明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；氟西汀干預(yù)組仔鼠耳蝸核BDNF和NSE免疫組化平均光密度值均有增加，即BDNF和NSE表達(dá)增強(qiáng)，其中氟西汀1.2mg/kg和0.8mg/kg組與產(chǎn)前應(yīng)激生理鹽水對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：