HIF-1α及VEGF在氟西汀抗大鼠肺埃及高壓作用機(jī)制研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension,PAH)是臨床上常見的一種疾病,表現(xiàn)為肺動(dòng)脈血管阻力持續(xù)增高,導(dǎo)致右心肥厚、衰竭甚至死亡。病理上主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈收縮性增強(qiáng)、肺中小動(dòng)脈血管構(gòu)型重建、微血栓形成以及炎癥反應(yīng),其中肺血管構(gòu)型重建為主要環(huán)節(jié)。肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,近年來5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)在肺動(dòng)脈高壓中的作用受到廣泛關(guān)注。
　　 肺動(dòng)脈高壓患者血漿中5-

2、HT水平明顯高于正常人,而體外實(shí)驗(yàn)證明高濃度的5-HT能使人離體肺血管明顯收縮。5-HT作為一種促有絲分裂素,由位于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(scrotonin transporter,5-HTT)介導(dǎo)進(jìn)入肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary mcry smooth muscle cells,PASMCs),并通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起PASMCs增生肥大,引起肺動(dòng)脈血管壁構(gòu)型重建。最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),5-HT作用于5-HT

3、T激活活性氧(reactive oxygen species,ROS)機(jī)制使ERK1/2磷酸化水平提高,進(jìn)而誘導(dǎo)牛的PASMCs增殖。并且有學(xué)者提出ROS-HIF通路參與PASMCs增殖作用。
　　 5-HT可通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,刺激新生的肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖,并且ROS還參與5-HT刺激平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的過程,因此在肺動(dòng)脈高壓的病理過程中,ROS可能發(fā)揮了重要作用。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia induced facto

4、r-1,HIF-1)與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生密切相關(guān),在缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中發(fā)揮重要作用。研究表明不僅在缺氧誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型中,在野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型中也有HIF-1α白表達(dá)水平的增高,表明HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中發(fā)揮重要作用。做為HIF-1α的下游效應(yīng)因子,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothdifl growth factor,VEGF)也參與了PAH的疾

5、病發(fā)生。VEGF通過影響ERK1/2磷酸化水平,參與平滑肌細(xì)胞的增殖、重構(gòu),而這一過程是否有5-HTT的參與,目前尚未見報(bào)道。
　　 目的：
　　 我們前期工作發(fā)現(xiàn)氟西汀通過抑制5-HTT可發(fā)揮抗肺動(dòng)脈高壓的作用,但是該機(jī)制是否有HIF-1α和VEGF的參與,目前尚無報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)擬用MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型,對(duì)VEGF、HIF-1α、ROS在肺動(dòng)脈高壓中的作用及氟西汀抗肺動(dòng)脈高壓的具體機(jī)制進(jìn)行研究。
　

6、　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 一、建立MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型
　　 體重200g左右的雄性Wistar大鼠32只,隨機(jī)分4組:Control組(Control)、MCT組(MCT)、MCT+氟西汀低劑量組(MCT-F2)和MCT+氟西汀高劑量組(MCT-F10)。MCT-F2組和MCT-F10組大鼠每天分別給予氟西汀2mg/kg和10mg/kg灌胃,各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3周。
　　 二、大鼠肺動(dòng)脈壓、右心室肥

7、厚指數(shù)檢測(cè)
　　 給藥21天后,戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉大鼠。將與壓力換能器連接并充滿肝素鹽水的PE250管插入插入右側(cè)頸外靜脈。插入過程中當(dāng)壓力基線上升并出現(xiàn)肺動(dòng)脈波形時(shí),開始描記肺動(dòng)脈壓。將大鼠處死取出心臟,仔細(xì)分離右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+S),濾紙吸水后,分別稱量RV和LV+S的重量,RV/(LV+S)即為右心指數(shù)。
　　 三、肺組織形態(tài)學(xué)及肺血管重構(gòu)檢測(cè)
　　 取大鼠右肺下葉固定,HE染

8、色。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)肺肌型小動(dòng)脈中膜厚度進(jìn)行測(cè)量分析。每組取4只大鼠,每只大鼠取外徑在50～100μm的20個(gè)肺肌型小動(dòng)脈,測(cè)其管壁厚度和血管外徑,用下面公式評(píng)估肺血管壁厚度:
　　 血管壁增厚指數(shù)=(血管壁厚度×2)/血管外徑×100％四、Western Blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)
　　 五、大鼠肺組織中ROS的定性及定量檢測(cè)
　　 使用GENMED活體組織氧化應(yīng)激活性氧

9、初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒,采用組織切片定性及組織勻漿定量方法進(jìn)行檢測(cè),在熒光顯微鏡及熒光分光光度計(jì)下進(jìn)行定性及定量檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)490nm,散發(fā)波長(zhǎng)520nm,綠色熒光增強(qiáng)表明活性氧含量高。
　　 六、Western Blot方法檢測(cè)肺組織磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)
　　 七、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織Ki67蛋白表達(dá)
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠平均肺動(dòng)脈壓及右心指數(shù)的影響

10、r>　　 與Control組相比,經(jīng)MCT處理的三組大鼠的體重明顯降低,Control組體重為275.6±38.7g,MCT組、MCT-F2組和MCT-F10組體重分別為229.9±32.3g、243±26.7g和233.7±31.9g。氟西汀治療組與MCT組體重?zé)o明顯差異。與Control組比較,MCT組大鼠的右心肥厚指數(shù)和平均肺動(dòng)脈壓則明顯升高。Control組的右心肥厚指數(shù)為26.6％±2.7％,MCT組則為54.4％±9.3％

11、(P＜0.01):Control組平均肺動(dòng)脈壓為16.6±3.0mmHg,MCT組則為30.5±4.9mmHg(P＜0.01),這提示肺動(dòng)脈高壓病理模型成功。與MCT組相比,MCT-F10組的右心肥厚指數(shù)和平均肺動(dòng)脈壓明顯降低,且有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而MCT-F2組與MCT組無明顯差異。
　　 二、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺小血管重構(gòu)的影響
　　 與Control組相比,MCT組肺小動(dòng)脈血管壁明顯增厚,肺小動(dòng)脈壁

12、厚度由14.7±4.1μm增至29.8±7.0μm(P＜0.01);血管壁增厚指數(shù)由41.0％±11.5％提高到78.2％±18.4％(P＜0.01)。而氟西汀10mg/kg可顯著降低MCT引起的肺血管壁增厚,肺小動(dòng)脈壁厚度和血管壁增厚指數(shù)分別降至22.1±3.2μm(P＜0.01)和59.8％±8.7％(P＜0.01)。
　　 三、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織形態(tài)學(xué)影響
　　 大鼠肺組織切片HE染色結(jié)果顯示,

13、Control組大鼠肺小動(dòng)脈管壁薄、管腔大,平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則均勻,內(nèi)皮細(xì)胞完整連續(xù)。MCT組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)不清,肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚,血管平滑肌細(xì)胞增生肥大,管腔明顯變小甚至形成管腔閉鎖,肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性破壞,細(xì)胞腫脹變性,并且肺小血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與MCT組比較,MCT-F2組形態(tài)學(xué)上沒有明顯改觀,而MCT-F10組肺組織結(jié)構(gòu)清楚,肺血管管壁變薄、平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則,血管周圍炎性細(xì)胞減少。以上結(jié)果都表明MCT可誘發(fā)明

14、顯的肺血管構(gòu)型重建,氟西汀明顯抑制了MCT引起的肺血管構(gòu)型重建。
　　 四、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)的大鼠肺組織HIF-1α蛋白表達(dá)的影響
　　 用Western Blot方法檢測(cè)大鼠肺組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,與Control組相比,MCT組大鼠肺組織中HIF-1α蛋白水平明顯提高,由1.91±0.17提高到2.81±0.41(P＜0.01)。MCT-F2組HIF-1α蛋白水平為2.26±0.58,MCT-F1

15、0組明顯降低,為1.95±0.51(P＜0.05)。為了明確HIF-1α在肺組織中表達(dá)部位,用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)HIF-1α在肺組織中的表達(dá)情況。在光鏡下(×200)觀察可見HIF-1α在細(xì)胞核中表達(dá),Control組很少有陽性細(xì)胞表達(dá),MCT組肺動(dòng)脈周圍陽性細(xì)胞數(shù)則明顯增多。MCT-F2組與MCT組無明顯差別,MCT-F10組陽性細(xì)胞數(shù)與MCT組比較顯著減少。
　　 五、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)的大鼠肺組織VEGF蛋白表達(dá)的影響

16、
　　 用Western blot方法檢測(cè)肺組織中VEGF蛋白表達(dá)。結(jié)果表明,與Control組相比較,MCT組VEGF蛋白的表達(dá)明顯增高,由0.55±0.24增加到1.07±0.30(P＜0.01)。氟西汀10mg/kg可以明顯的抑制VEGF表達(dá),蛋白水平降至0.82±0.22(P＜0.01)。氟西汀2mg/kg對(duì)VEGF表達(dá)幾乎沒有影響,表達(dá)水平為1.01±0.29(P＞0.05)。用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠肺組織中VEGF

17、蛋白的表達(dá),鏡下可見VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜,Control組大鼠肺組織中氣道上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均有VEGF表達(dá)。MCT可以明顯刺激VEGF的蛋白表達(dá),在肺血管上皮細(xì)胞,肺血管平滑肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞中都有明顯的棕黃色陽性細(xì)胞。與MCT組相比,MCT-F2組無明顯改變,而MCT-F10組的大鼠肺組織切片中VEGF染色陽性細(xì)胞明顯減少,提示氟西汀10mg/kg可抑制VEGF在肺組織中的表達(dá)。
　　 六、氟

18、西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)的大鼠肺組織ROS含量的影響
　　 野百合堿可以明顯的促進(jìn)大鼠肺組織ROS的產(chǎn)生。與Control組相比,MCT組ROS含量Control組為0.39±0.16,MCT組0.76±0.43(P＜0.05)。與MCT組相比,氟西汀可以降低肺組織ROS含量,MCT-F2組下降為0.56±0.39,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);MCT-F10組下降為0.43±0.07(P＜0.05)。這表明氟西汀10mg/kg可以明

19、顯抑制MCT誘導(dǎo)大鼠肺組織中ROS的產(chǎn)生。
　　 肺組織切片中ROS的定量檢測(cè)結(jié)果則表明ROS在肺組織中主要表達(dá)于肺血管平滑肌層及氣道的平滑肌層。Control組大鼠肺組織中ROS在肺血管中的表達(dá)水平很低,MCT可以明顯的促進(jìn)肺血管平滑肌中ROS的表達(dá),在熒光顯微鏡下可以觀察到耀眼的綠色熒光。氟西汀10mg/kg可以明顯的抑制MCT誘導(dǎo)的ROS,在熒光顯微鏡下MCT-F10組的綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱,但強(qiáng)于Control組。

20、>　　 七、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)的大鼠肺組織磷酸化ERK1/2的影響
　　 Western blot結(jié)果顯示,與Control組相比MCT組大鼠肺組織中ERK1/2磷酸化水平明顯升高,由0.42±0.17升到0.82±0.32(P＜0.01),氟西汀10mg/kg可以明顯拮抗MCT誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化水平升高0.46±0.19(P＜0.01)。氟西汀2mg/kg對(duì)ERK1/2磷酸化水平無明顯影響,為0.52±0.24(P＞0

21、.05)。
　　 八、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)的大鼠肺組織中Ki67表達(dá)的影響
　　 免疫組織化學(xué)研究結(jié)果表明,與Control組相比MCT組大鼠的肺組織中Ki67表達(dá)水平增高,陽性細(xì)胞表達(dá)率由4.51±1.81上升為23.6±5.10(P＜0.01)。與MCT組相比,氟西汀2mg和10mg分別將其降至22.65±5.82和4.17±1.91(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 一、本研究明確MCT可導(dǎo)致大鼠