解偶聯(lián)蛋白3在抗心臟缺血-再灌注損傷中的作用和機(jī)制.pdf

1、目的：
　　心肌梗塞后及時(shí)再灌注是挽救缺血心肌必需的步驟，但該過(guò)程伴隨著嚴(yán)重的再灌注損傷。缺血/再灌注造成的線粒體Ca2+（[Ca2+]m）超載和活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量釋放并導(dǎo)致線粒體嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)和功能破壞，是心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的主要原因。因此尋找保護(hù)線粒體的關(guān)鍵靶點(diǎn)，對(duì)于深入理解缺血/再灌注導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷機(jī)制，進(jìn)而提出心肌保護(hù)的新策略至關(guān)重要。ROS不僅參與細(xì)胞損傷，

2、適量ROS通過(guò)激活細(xì)胞保護(hù)信號(hào)通路介導(dǎo)缺血預(yù)處理/后處理的抗心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。線粒體是調(diào)控心肌細(xì)胞活性氧產(chǎn)生、Ca2+穩(wěn)態(tài)和收縮功能的重要細(xì)胞器之一。在缺血/再灌注過(guò)程中過(guò)度釋放的活性氧以及線粒體 Ca2+超載都被證明可以打開(kāi)線粒體膜通透性通道(mitochondrial permeability transition pores,MPTP)，進(jìn)而造成心肌細(xì)胞的凋亡和壞死。因此理解和闡明在缺血/再灌注過(guò)程中線粒體ROS大量

3、釋放與Ca2+超載的發(fā)生原因以及 MPTP的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于找到有效的心肌保護(hù)措施是至關(guān)重要的。線粒體解偶聯(lián)蛋白（mitochondrial uncoupling proteins，UCPs）位于線粒體內(nèi)膜上，UCPs通過(guò)降低ROS的產(chǎn)生以及保護(hù)線粒體功能來(lái)保護(hù)心臟抵抗缺血/再灌注損傷造成的心臟功能紊亂，但是UCP3如何影響線粒體的活性氧的釋放、[Ca2+]m穩(wěn)態(tài)以及MPTP的開(kāi)放及其分子機(jī)制目前都不清楚。因此，本研究旨在闡明如下問(wèn)題：

4、1）UCP3在過(guò)氧化氫預(yù)處理(hydrogen peroxide preconditioning，H2O2PC)保護(hù)模型中的作用；2）UCP3對(duì)[Ca2+]m超載，線粒體 ROS釋放以及MPTP開(kāi)放的作用；3）UCP3與MPTP組分的關(guān)系及作用機(jī)制；4）保護(hù)性信號(hào)通路在UCP3心肌保護(hù)中的作用。
　　方法：
　　雄性SD大鼠（280-320克）隨機(jī)分為對(duì)照組和H2O2PC組，利用Langendorff灌流模型，進(jìn)行30分鐘缺

5、血繼之45分鐘再灌注，觀察記錄心功能指標(biāo)的變化。收取缺血前、缺血后和再灌注后左心室心肌組織，利用western blot和QPCR的方法檢測(cè)心肌組織中UCP3基因和蛋白表達(dá)量。分別構(gòu)建UCP3下調(diào)(AdshUCP3)和UCP3過(guò)表達(dá)(AdUCP3)腺病毒載體并感染大鼠心臟和原代分離的心肌細(xì)胞，檢測(cè)缺血/再灌注過(guò)程中心臟收縮舒張功能和心肌壞死以及心肌細(xì)胞收縮功能和鈣瞬變，評(píng)價(jià)UCP3對(duì)缺血/再灌注過(guò)程中心臟/心肌細(xì)胞收縮功能和心肌細(xì)胞存活

6、的影響以及其在H2O2PC保護(hù)模型中的作用。為研究UCP3對(duì)缺血/再灌注過(guò)程中心肌細(xì)胞線粒體功能的影響，我們利用心肌細(xì)胞模擬缺血（20分鐘）/再灌注(30分鐘)模型，用Rhod-2、MitoSOX和TMRE熒光染料分別實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)線粒體[Ca2+]m超載、線粒體ROS的釋放和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,ΔΨm）的變化。采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP

7、）方法分析UCP3蛋白與MPTP蛋白組分的相互作用。進(jìn)一步利用western blot方法研究UCP3在心肌缺血/再灌注損傷及其保護(hù)中對(duì)保護(hù)性信號(hào)通路的影響。利用特異開(kāi)放劑或抑制劑分析MPTP和PI3K/Akt信號(hào)通路在UCP3心肌保護(hù)中的重要作用及其調(diào)控方式。
　　結(jié)果：
　　H2O2PC顯著改善大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷后左心室收縮舒張功能恢復(fù)及冠脈流量并降低心肌梗死面積。QPCR及western blot結(jié)果顯示H2

8、O2PC明顯增加UCP3基因和蛋白表達(dá)量。AdshUCP3和AdUCP3腺病毒分別過(guò)表達(dá)和下調(diào)UCP3表達(dá)水平證實(shí)UCP3高表達(dá)介導(dǎo)并且模擬H2O2PC對(duì)抗心肌缺血/再灌注造成的心臟/心肌細(xì)胞收縮舒張功能損傷以及心肌梗死，而單獨(dú)下調(diào)UCP3的表達(dá)并不改變正常及缺血/再灌注過(guò)程中心臟和心肌細(xì)胞的收縮舒張功能。UCP3介導(dǎo)并能模擬H2O2PC降低缺血/再灌注損傷造成的[Ca2+]m超載、線粒體ROS大量釋放以及ΔΨm的喪失。Co-IP結(jié)果分

9、析表明UCP3與MPTP的蛋白組分之一ANT相互作用，而不是其他組分。Western blot結(jié)果顯示，UCP3下調(diào)取消由于缺血/再灌注造成的心肌細(xì)胞中內(nèi)源保護(hù)信號(hào)蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和糖原合成酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）磷酸化水平的升高。并且，UCP3能介導(dǎo)和模擬H2O2PC升高缺血/再灌注過(guò)程中Akt和GSK-3β磷酸化水平的影響。進(jìn)而，我們利用L

10、angendorff灌流和離體心肌細(xì)胞模型研究 MPTP和PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路在H2O2PC和UCP3的心肌保護(hù)中的作用。應(yīng)用MPTP直接開(kāi)放劑atractyloside（ATR）完全取消H2O2PC和UCP3過(guò)表達(dá)對(duì)心臟/心肌細(xì)胞收縮功能以及心肌梗死的保護(hù)作用，而PI3K的抑制劑wortmannin只能部分取消H2O2PC和UCP3過(guò)表達(dá)的保護(hù)作用。
　　結(jié)論：以上結(jié)果表明，H2O2PC顯著升高心肌內(nèi)UCP3的

11、表達(dá)，而UCP3介導(dǎo)和模擬H2O2PC在缺血/再灌注過(guò)程中改善心功能回復(fù)、降低心肌梗死面積、降低[Ca2+]m超載、抑制線粒體 ROS大量釋放及防止ΔΨm喪失的作用。H2O2PC和UCP3過(guò)表達(dá)一方面通過(guò)UCP3直接與MPTP通道蛋白ANT相互作用而抑制MPTP的開(kāi)放起到保護(hù)作用，另一方面可以啟動(dòng)保護(hù)性信號(hào)通路PI3K/Akt/GSK-3β。MPTP在H2O2PC和UCP3的抗心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用起決定性作用，而PI3K/Ak