多ADP-核糖聚合酶在大鼠心臟缺血-再灌注損傷中的作用及其機(jī)制.pdf

1、隨著人們生活水平的提高，心血管疾病已成為現(xiàn)今威脅人類生命健康的最主要?dú)⑹种弧Ｐ难芗膊∽钪饕乃劳鲈蚴枪谛牟?。?duì)于冠心病的治療原則是盡快恢復(fù)血液灌注。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，隨著血運(yùn)的恢復(fù)，某些受損的心肌細(xì)胞功能及結(jié)構(gòu)破壞反而加重，即缺血再灌注損傷(Ischemia andreperfusion injury，I/R)。再灌注損傷是在心肌缺血后再灌注的過程中，因氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量氧自由基、超氧陰離子等，加速心肌細(xì)胞凋亡和壞死，使

2、心肌梗死范圍擴(kuò)大、心功能惡化。臨床表現(xiàn)為在閉塞的冠狀動(dòng)脈再通及梗死區(qū)血液灌流重建后一段時(shí)間內(nèi)，有的患者發(fā)生血壓驟降、心功能不全、心律失常甚至猝死等一系列病情惡化的現(xiàn)象。臨床實(shí)踐中如心肌梗死溶栓再通后、冠脈搭橋、心臟移植、心臟驟停心臟復(fù)蘇后、體外循環(huán)心臟手術(shù)后等均存在再灌注損傷問題。如何做到既保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流，又減輕甚至解除再灌注損傷的發(fā)生便成為缺血性心臟病防治中的重要課題。有效防治再灌注損傷的重要前提是闡明其發(fā)病機(jī)制。因此，關(guān)

3、于I/R病理機(jī)制的研究越來越受到廣大基礎(chǔ)和臨床工作者的重視。 最近，一種新的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的酶--多ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]被提出。PARP是一個(gè)家族酶，包括：PARP-1、PARP-2、PARP-3、tankyrase-1、tankyrase-2、sPARP、vPARP。廣泛存在于真核細(xì)胞核內(nèi)，具有蛋白修飾和核苷酸聚合作用。環(huán)境刺激、自由基、氧化劑和基因毒性介質(zhì)所引起的

4、DNA鏈的缺口或斷裂均可引起PARP活化。PARP在體內(nèi)的作用取決于DNA的損傷程度。少量的DNA損傷引起的PARP活化時(shí)，通過裂解底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生成ADP-核糖，引起包括PARP自身在內(nèi)的多種蛋白酶發(fā)生多聚(ADP-核糖)基化，參與DNA鏈的修復(fù)。但大量DNA損傷時(shí)PARP過度活化，利用NAD+形成大量的(ADP-核糖)聚合物，機(jī)體在重新生成NAD+時(shí)將消耗ATP，能量耗竭將最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在大多數(shù)疾病過程如炎

5、癥、循環(huán)休克和I/R中產(chǎn)生大量的自由基和氧化劑導(dǎo)致大量DNA損傷，PARP被持續(xù)過度激活，NAD+被大量消耗，從而影響糖酵解、三羧酸循環(huán)和線粒體的電子傳遞，ATP耗竭，細(xì)胞因DNA的修復(fù)不敵能量的消耗而死亡。這樣導(dǎo)致疾病的惡化，而疾病惡化又會(huì)進(jìn)一步激活PARP，形成惡性循環(huán)。研究表明PARP的過度激活在心肌I/R損傷、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)展過程中起重要的作用。盡管目前的研究表明PARP在心臟I/R損傷中發(fā)揮重要的作用，但是

6、其中的機(jī)制卻遠(yuǎn)未清楚。例如PARP調(diào)控哪些細(xì)胞因子，通過哪些信號(hào)途徑發(fā)揮作用，這些問題構(gòu)成了本研究課題的內(nèi)容。在本研究中，我們擬以大鼠為研究對(duì)象，建立心臟I/R模型，檢測(cè)心肌中PARP的表達(dá)，PARP對(duì)心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗死面積的影響，并探討PARP對(duì)心肌中炎癥因子的調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞凋亡有關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。通過以上研究，進(jìn)一步明確PARP在心臟I/R損傷中所起的作用及其機(jī)制。這對(duì)于闡明冠心病的發(fā)病機(jī)制，為冠心病提供新的治療途徑具有重要的意義

7、。 本研究共分三部分進(jìn)行。 第一部分:多ADP-核糖聚合酶在大鼠心臟I/R損傷中的作用 目的： 本部分研究擬建立大鼠心臟I/R模型，應(yīng)用藥物3，4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxy]-1(2H)-isoquinolinone(DPQ)抑制PARP在心肌中的表達(dá)，測(cè)定心肌細(xì)胞的凋亡、心肌梗死面積，明確PARP在大鼠心臟I/R損傷中的作用。 方法： 1.大鼠

8、心臟I/R損傷模型的建立和分組：采用開胸結(jié)扎和松開冠狀動(dòng)脈的方法建立大鼠心臟I/R損傷模型。分為以下四組：對(duì)照組、I/R組、I/R+DPQ組和I/R+DMSO(二甲基亞砜)組。 2.心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。按照試劑盒說明書操作。標(biāo)記前用DNA酶處理切片做陽性對(duì)照，用標(biāo)記液代替TdT酶反應(yīng)液做陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野(×400倍)，計(jì)

9、數(shù)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)和所有細(xì)胞個(gè)數(shù)，以凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù)反映各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。 3.心肌梗死面積檢測(cè)：采用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色檢測(cè)各組大鼠心肌梗死面積。染成藍(lán)色部分為存活心肌，非染色部分為梗死心肌。用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)切片的面積、心肌梗死面積，計(jì)算心室肌總面積和心室肌梗死總面積，算出梗塞心肌面積占心室面積百分比。 4.應(yīng)用電鏡和HE染色檢測(cè)各組大鼠心肌的損傷。 結(jié)論 1.在大鼠心

10、肌I/R損傷中PARP明顯激活，激活的PARP能加重心臟的損傷。 2.抑制PARP在大鼠心臟I/R中的激活能減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞的凋亡率，減輕心肌細(xì)胞的損傷程度，具有心臟保護(hù)作用。 第二部分:PARP對(duì)核因子-kB活性及炎癥因子的調(diào)節(jié) 目的 探討在大鼠心臟I/R中PARP對(duì)心肌組織中核因子-kB(NF-kB)活性及炎癥因子的調(diào)節(jié)。 方法： 1.大鼠心臟I/R損傷模型的建立和分組：采用開胸結(jié)扎

11、和松開冠狀動(dòng)脈的方法建立大鼠心臟I/R損傷模型。分為以下四組：對(duì)照組、I/R組、I/R+DPO組和I/R+DMSO組。 2.采用電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)檢測(cè)各組大鼠核因子-kB(NF-KB)的活性。 3.采用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western Blot方法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)，環(huán)氧化酶-2(COX-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)mRNA和蛋白的表達(dá)。

12、 結(jié)論： 1.在大鼠心臟I/R損傷中NF-κB活性增強(qiáng)，ICAM-1、COX-2、MMP-9等炎癥因子表達(dá)明顯增加。 2.在大鼠心臟I/R中PARP能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB的活性和ICAM-1、COX-2、MMP-9等炎癥因子表達(dá)導(dǎo)致心臟損傷。 3.抑制PARP能降低I/R大鼠心肌中NF-κB的活性以及ICAM-1、COX-2、MMP-9等炎癥因子表達(dá)，減輕心臟損傷。 第三部分:PARP對(duì)凋亡誘導(dǎo)因子(

13、AIF)和Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié) 目的： 探討在大鼠心臟I/R中PARP)對(duì)AIF的調(diào)節(jié)，PARP對(duì)Akt及其下游分子糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)和叉頭蛋白(FOX03a)的調(diào)節(jié)。(PARP/JNK/AIF和PARP/Akt信號(hào)通路在大鼠心臟I/R損傷中的作用) 方法： 1.大鼠心臟I/R損傷模型的建立和分組：采用開胸結(jié)扎和松開冠狀動(dòng)脈的方法建立大鼠心臟I/R損傷模型。分為以下六組：對(duì)照組、I/R組、

14、I/R+DPQ組、I/R+DMSO組、I/R+DPQ+LY294002(Akt抑制劑)組和I/R+SP600125(JNK抑制劑)組。 2.采用Western Blot檢測(cè)各組大鼠心肌中PARP、JNK、AIF、Akt、GSK-3β和FOXO3a的表達(dá)結(jié)果1.抑制PARP減少JNK的表達(dá)：在I/R組大鼠心肌中磷酸化JNK表達(dá)增多，應(yīng)用DPQ后磷酸化JNK的表達(dá)下降，說明磷酸化JNK的表達(dá)與PARP有關(guān)，JNK是PARP的下游分子

15、。 2.抑制PARP減少AIF從心肌細(xì)胞核到線粒體的轉(zhuǎn)移：在I/R組大鼠心肌細(xì)胞核中AIF的表達(dá)增多，抑制PARP后其表達(dá)減少；另一方面，在I/R組大鼠心肌細(xì)胞線粒體中AIF的表達(dá)減少，而抑制PARP后其表達(dá)增多。說明抑制PARP可以減少AIF從線粒體向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，證實(shí)AIF是PARP的下游分子。 3.抑制JNK減少AIF的從心肌細(xì)胞核到線粒體的轉(zhuǎn)移：在I/R組大鼠心肌細(xì)胞核中AIF的表達(dá)增多，抑制JNK后其表達(dá)減少；

16、另一方面，在I/R組大鼠心肌細(xì)胞線粒體中AIF的表達(dá)減少，而抑制JNK后其表達(dá)增多。說明抑制JNK可以減少AIF從線粒體向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，證實(shí)AIF是JNK的下游分子。 結(jié)論： 1.在大鼠心臟I/R損傷模型中，PARP調(diào)節(jié)AIF從線粒體向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，在這個(gè)過程中，JNK起了重要的作用。PARP通過JNK來發(fā)揮調(diào)節(jié)AIF的作用。PARP/JNK/AIF信號(hào)通路是介導(dǎo)大鼠心臟I/R損傷的一條重要的通路。 2.在大鼠心