1型多聚ADP-核糖聚合酶在大鼠心肌缺血再灌注損傷中活性變化的實驗研究.pdf

1、前言：
　　 目前減輕急性心肌梗死缺血性損傷的有效手段是盡早實施再灌注治療,而再灌注同時會增加心肌損傷,包括微血管損傷、心律失常以及心肌細胞壞死的擴展。但關于心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷確切的細胞機制仍未被完全清晰地闡明,心肌血流的中斷和再恢復將觸發(fā)許多病理生理過程,其中作為多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)家族中最豐富的同工酶P

2、ARP-1的過度活化可能成為研究的關鍵,它或許是動物模型再灌注過程中介導氧化誘導的細胞功能障礙和死亡的一個關鍵途徑。
　　 已知PARP-1涉及壞死性細胞死亡,這種死亡與細胞凋亡和自噬相比較,代表了一種更嚴重的細胞終結形式。廣泛的DNA損傷(活性氧如過氧亞硝酸鹽,羥基和超氧自由基)導致PARP過度活化從而消耗細胞內的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotin amideadenine dinucleotide,NAD+)儲備,降低NA

3、D+水平并通過氧化磷酸化抑制三磷酸腺苷(adenosine triphos phate,ATP)的產生,導致壞死性細胞死亡。PARP過度活化所致的細胞壞死性死亡與缺血再灌注損傷中由PARP-1抑制或缺失所提供的顯著的細胞保護作用相一致,而缺血再灌注損傷主要以壞死性細胞死亡為特征。因此,壞死是一種普遍的死亡方式并且也能被調控,研究證實PARP-1在與壞死和炎癥相關的缺血再灌注損傷中起到至關重要的作用,因此,PARP抑制劑可使此類疾病明顯獲

4、益,目前少數PARP抑制劑已進入臨床試驗階段。最新研究顯示,自由基-介導的PARP活化作用并不僅限于心肌,循環(huán)白細胞同心肌細胞一樣在再灌注后同樣存在著PARP過度活化。
　　 在此背景下,本研究旨在探討循環(huán)白細胞內PARP激活能否作為再灌注心肌中PARP活化的一個監(jiān)測指標。為此,我們應用大鼠首先測定PARP活化的終產物多聚ADP-核糖(poly(ADP-ribose),PAR)的含量,以明確心肌缺血再灌注損傷進程中循環(huán)白細胞和再

5、灌注心肌中PARP活化情況。其次,我們進一步明確循環(huán)白細胞內PARP活化程度與心肌梗死范圍的關系。最后,我們探討PARP抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)對PARP活性的作用及其在心肌缺血的在體模型中提供心肌保護的治療時間窗。
　　 目的：
　　 建立大鼠心臟I/R模型,檢測再灌注早期不同時點心肌和外周血白細胞內PARP-1活化產物PAR的表達;同時測定心肌梗死范圍,探討外周血白細胞PA

6、RP-1活化與心肌PARP-1活化間的關系,及其與心肌損傷間的關系。最后,探討PARP抑制劑3-AB對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其有效給藥時間。
　　 方法：
　　 1、大鼠心臟I/R損傷模型的建立和分組
　　 采用開胸結扎和松開冠狀動脈的方法建立大鼠心臟I/R損傷模型。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,氣管切開插管行小動物呼吸機輔助呼吸,呼吸頻率75次/min。在第四肋間行左胸廓切開術,暴露心臟,打開心

7、包,擠出大部分心臟。暴露肺動脈圓錐與左心耳根部間的左冠狀靜脈。以左冠狀靜脈為標志,用5-0縫線在左冠狀靜脈下穿線,連同左冠狀靜脈一起在距冠狀動脈前降支根部1-2mm形成一個直徑約5mm的活結,將5mm聚乙烯軟管置于活結中。45min后拔出聚乙烯軟管,使冠狀動脈血流再通,在整個缺血和再灌注過程中,一直監(jiān)測大鼠肛溫,通過熱摯和臺燈維持大鼠體溫在37-38℃。
　　 (1)缺血再灌注不同時點PAR在心肌以及外周血白細胞內表達,隨機分為

8、:sham組;I/R0min組;FR15min組;I/R2h組;I/R6h組;I/R24h組
　　 另設一組,通過輕微改變冠脈結扎位置來獲得一個較廣泛的心肌梗死范圍進一步明確缺血再灌注不同時點外周血白細胞PARP-1活化與心肌損傷間的關系,隨機分為:I/R2h組;I/R6h組;I/R24h組
　　 (2)為明確PARP抑制劑3-AB對大鼠心肌缺血再灌注2h后心肌梗死范圍以及PARP活化的影響,隨機分組為假手術+生理鹽水組

9、、假手術+3-AB組、I/R2h+生理鹽水組、I/R2h+3-AB組,3-AB(20mg/kg,每2小時,于再灌注前15分鐘iv.給藥)。
　　 為明確PARP抑制劑3-AB對大鼠心肌缺血再灌注24小時的心肌保護作用及其有效給藥時間,另設一組為I/R24h+生理鹽水組、I/R24h+3-AB組,3-AB(20mg/kg,分別于再灌注前15分鐘、再灌注后15分鐘、2小時、4小時iV.給藥)。
　　 2、外周血白細胞的準備<

10、br>　　 抽取肝素化抗凝全血6ml,應用單個核細胞分離液,采用密度梯度離心方法分離單個核細胞。將6mlHistopaque-1083置于離心管底部,輕移6ml抗凝全血至其頂部,室溫下以800g離心15分鐘,后用吸管抽吸血漿層至0.5cm厚包含單個核細胞的不透明層,收集分離的單個核細胞使用梯度降溫法于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　 3、心肌缺血危險區(qū)、梗死范圍檢測
　　 采用伊文氏蘭-氯化三苯基四氮唑(tripheny

11、ltetrazoliumchloride,TTC)染色檢測各組缺血危險區(qū)(areaatrisk,AAR)及心肌梗死面積(infarctsize,IS)。再灌注結束時,再次原位結扎冠狀動脈,從左心室腔注入2%伊文氏蘭3ml,未缺血心肌組織染成藍色,缺血心肌不染色,即為缺血危險區(qū)。剪去右心室和心房,凍存后切厚度為2mm的橫斷面切片4-5個,缺血左室部分置于37℃下1%的TTC溶液中孵育20分鐘,染色后將心臟切片以10%甲醛溶液固定6h。三種

12、顏色(白,紅和藍)分別代表梗死區(qū)、非梗死的缺血區(qū)和非缺血區(qū),非梗死的缺血區(qū)和梗死區(qū)一起作為缺血危險區(qū)。缺血危險區(qū)用缺血危險區(qū)心肌重量與左室重量之比(AAR/LV%)表示,而梗死區(qū)范圍用梗死區(qū)心肌重量與缺血危險區(qū)心肌重量之比(IS/AAR%)表示。
　　 4、WresternBlot以及免疫組織化學方法檢測各組心肌和外周血白細胞的PARP活化產物PAR表達。
　　 采用WesternBlot方法檢測各組心肌和外周血白細胞的

13、PAR表達。取組織或細胞勻漿液離心后應用Bradford進行蛋白含量檢測。取蛋白20μL(50μg)上樣于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠上,電泳電壓120V,轉膜后封閉,按照1:400稀釋PAR,1:2000稀釋β-actin抗體37℃孵育1小時,放入4℃冰箱過夜進行一抗雜交,取相對應二抗雜交,電化學發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)發(fā)光,將膠片于成像系統(tǒng)中拍照,以QuantityOne4.6.2成像

14、軟件分析電泳帶的灰度值,以PAR目的片段(116kd)的灰度值與相應的β-actin的灰度值的比值為各個樣本PAR表達量的比例。
　　 采用免疫組化方法檢測各組缺血心肌PAR表達。心肌標本用4%多聚甲醛固定,連續(xù)切片4μm厚,滴加1:100稀釋小鼠PAR單克隆抗體,4℃孵育過夜,加生物素標記的馬抗小鼠二抗,37℃孵育20min,加親和素-生物素-過氧化物酶復合物(avidin-biotin-peroxidasecomplex,A

15、BC)-辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase.HRP)37℃孵育后,二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidineDAB)顯色,蘇木素復染。
　　 結果：
　　 1、大鼠心肌缺血45分鐘再灌注不同時點導致心肌不同程度的損傷。
　　 2、大鼠心肌缺血45分鐘后,不同時點(0min、15min、2h、6h、24h)的再灌注心肌以及外周血白細胞內存在不同程度PARP-1活化產物PAR的表

16、達。缺血45分鐘再灌注0min,心肌PARP-1無明顯活化,而再灌注后15min心肌PARP-1活性即刻顯著增高,再灌注2h-6h達峰值,并持續(xù)活化至再灌注24h。PAR染色主要位于缺血心肌細胞、血管內皮細胞以及浸潤的單核細胞核內。同時點檢測出外周血白細胞內PARP-1活化變化同心肌改變相似。
　　 3、再灌注早期不同時點外周血白細胞和心肌PARP-1活化產物PAR的表達具有相關性(r2=0.692,P＜0.001)。
　

17、　 4、再灌注6h外周血白細胞PARP.1活化產物PAR的表達與心肌梗死大小具有相關性(r2=0.836,P＜0.001),而再灌注2h(r2=0.341,P=0.076)和24h(r2=0.119,P=0.33)未發(fā)現(xiàn)二者存在相關性。
　　 5、PARP抑制劑3-AB顯著減少大鼠再灌注2h心肌梗死范圍(57.6±2.7%vs.40.9±2.3%,P＜0.001)。
　　 6、PARP抑制劑3-AB有效抑制再灌注2h大

18、鼠外周血白細胞及心肌PARP活化。假手術組大鼠心肌中只有微弱的PAR表達。I/R組大鼠外周血白細胞及心肌中的PAR表達明顯增加(P＜0.001),應用3-AB后,PAR表達降低,與I/R組相比P＜0.05。
　　 7、PARP-1抑制劑3-AB有效治療時間窗:再灌注前15分鐘(49.3±1.7%vs.67.3±1.8%,P＜0.001)和延遲給藥再灌注后15分鐘(52.2±2.1%vs.66.5±2.6%,P=0.001)、2小

19、時(56.6±1.7%vs.67.1±2.2%,P＜0.05)均具有保護作用,而延遲給藥至再灌注后4小時未能減小梗死范圍(59.1±2.3%vs.66.2±2.7%.)。
　　 結論：
　　 再灌注早期循環(huán)白細胞PAR表達與心肌PAR表達存在正相關,再灌注6h外周血白細胞PARP-1活化產物PAR的表達與心肌梗死大小具有相關性,循環(huán)白細胞的PARP-1活化可能作為臨床監(jiān)測再灌注損傷的特異性標志物。PARP-1抑制劑3-A