中國非小細(xì)胞肺癌患者EGFR雙突變的分子流行病學(xué)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文中國非小細(xì)胞肺癌患者EGFR雙突變的分子流行病學(xué)及生物學(xué)特性研究姓名：張國淳申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：吳一龍20070430LL_l冉I寧竹論上。IⅢ扯小細(xì)胞種艋吉占EGFR“突變的舒f贏j抽卞，乏’l物卞持性研宄I正捕霍突變的分了流iJ病學(xué)研究，了解EGFR雙突變的分布規(guī)律并進(jìn)步通過仆外實驗明確其生物學(xué)釣性以指導(dǎo)臨床個體化TKI治療的用藥選擇。方法1非選擇性中國人NSCLC患者肺癌組織標(biāo)本的EGFR測

2、序2004年1月至2005年7月期間，“東省人民醫(yī)院腫瘤巾心收治的非小細(xì)H色I(xiàn)肺癌患者，采用Trizol法及石蠟包埋組織DNA提取法獲得所有標(biāo)本的皋岡DNA進(jìn)行PCR測序。除對EGFR的18，19，21外顯f測序外，接受過Gefitmib治療的病例還進(jìn)行KRAS第2顯子及EGFR笫20外顯子的耐藥性突變榆測。2EGFR雙突變的等位基因定位實驗提取攜帶EGFR雙突變的肺癌組織的總RNA進(jìn)行EGFRl821外顯f全K的RTPCR，并使用pM

3、Dl8T載體進(jìn)行TA克隆測序，分析EGFR雙突變的等位毖因分卻情況。3EGFR雙突變表達(dá)載體的構(gòu)建利用Stratagene公司開發(fā)的QuickChangeXL定點突變試劑盒將L858R定點突變劍己插入了EGFRdelE746一A750的peDNA31(一)表達(dá)載體上，從而構(gòu)建EGFRdelE746A750／L858R雙突變表達(dá)載體。通過雙酶切及EGFR開放讀碼柜全長測序進(jìn)行鑒定。4TKIs藥敏實驗將構(gòu)建成功的EGFR雙突變以及delE7

4、46A750，L858R兩種單突變載體與野生型載體通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的方法分別瞬時轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染40小時后以分別以Gefitinib與Erlotinib濃度梯度處理3小時。處理完成后以EGF刺激誘導(dǎo)EGFR磷酸化。收集細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行EGFRTyrl068位點磷酸化的WesternBlotting檢測。使用QuantityOne光密度分析軟件對WesternBlotting的結(jié)果進(jìn)行分析，獲得EGFR磷酸化被TKIs抑制程度的比