CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54、CHO-MBLm57高表達(dá)株篩選及產(chǎn)物生物學(xué)特性研究.pdf

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-bindinglectin,MBL)是哺乳動物C型凝集素超級家族中膠凝素家族成員,主要由肝細(xì)胞分泌,作為糖蛋白存在于血漿中。MBL通過與2個MBL,相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineprotease,MASP-1,MASP-2)結(jié)合而激活補(bǔ)體凝集素途徑,在天然免疫中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3個可導(dǎo)致血清(漿)MBL水平低下并進(jìn)而引起調(diào)理吞噬缺損的MBL結(jié)構(gòu)基因點(diǎn)突變:CGT52TGT

2、、GGC54GAC和GGA57GAA,其編碼產(chǎn)物的改變分別是Arg→Cys、Gly→Asp及Gly→Glu。這些點(diǎn)突變?yōu)槌Ｈ旧w顯性遺傳,其基因頻率在不同種族人群中差異甚大,但總體來說極高,如第52位密碼突變在所研究過的人群中相對較低(≤0.1),第54位密碼突變在歐亞人群中有較高頻率(0.11～0.14),而第57位密碼突變在撒哈拉非洲人群中的頻率很高(0.23～0.29)。顯然,MBL缺損是迄今所發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳性免疫缺損病,而各

3、種病原體的反復(fù)感染與MBL缺損密切相關(guān)。然而,MBL基因突變引起免疫缺損的機(jī)理迄今尚未完全清楚。
　　 本課題組曾將相同質(zhì)量數(shù)的野生型和3種突變型MBL真核表達(dá)載體用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染入相同數(shù)目的COS7細(xì)胞中,72h后檢測各目的蛋白的分泌量。將4種(1種野生型基因轉(zhuǎn)染COS7和3種突變型基因轉(zhuǎn)染COS7)細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測出的蛋白進(jìn)行One-wayANOVA分析,發(fā)現(xiàn)4種細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的量沒有顯著性差異(P>0.05),

4、由此證明,MBL結(jié)構(gòu)基因點(diǎn)突變并不影響MBL蛋白的合成與分泌。
　　 既然MBL結(jié)構(gòu)基因點(diǎn)突變并不影響蛋白的合成與分泌,那是什么因?yàn)閷?dǎo)致了血清(漿)MBL水平低下,是突變蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定還是功能異常?為了進(jìn)一步闡明MBL的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,揭示MBL缺損的實(shí)質(zhì),我們需要得到野生型和突變型MBL基因的穩(wěn)定表達(dá)產(chǎn)物,以便研究其生物學(xué)特性。在本研究中,我們將本室保存的已轉(zhuǎn)染4種真核表達(dá)載體(pcDNA4/HisMaxC-MBLw、pcD

5、NA4/HisMaxC-MBLm52、pcDNA4/HisMaxC-MBLm54和pcDNA4/HisMaxC-MBLm57)的CHO細(xì)胞株(CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57)進(jìn)行為期2個月的篩選,通過雙抗體夾心ELISA技術(shù)篩選得到了高效穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的單克隆細(xì)胞株,并對其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行了較為深入的研究。將轉(zhuǎn)染空載體pcDNA4/HisMaxC的CHO細(xì)胞進(jìn)行平行處理,作為陰性對

6、照,命名為CHO-pcDNA4C。
　　 一、雙抗夾心ELISA體系的建立建立了兩種雙抗體夾心ELISA體系,用于檢測培養(yǎng)上清中目的蛋白的濃度,篩選高效表達(dá)株。第一種夾心體系:利用MBL是多聚體的特性,捕獲抗體為鼠抗人MBL-CRDmAb,檢測抗體為Biotin-抗MBL-CRDmAb,推測由于空間位阻的關(guān)系,該體系檢測靈敏度不夠,僅為2.5mg/L；第二種夾心體系:捕獲抗體為鼠抗人MBL-CRDmAb,檢測抗體為商品化HRP-

7、抗HisG單克隆抗體,該體系靈敏度為0.3mg/L。檢測用標(biāo)準(zhǔn)品均為野生型重組人MBL蛋白。
　　 二、野生型和突變型MBL基因轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞穩(wěn)定高效表達(dá)株的篩選本課題組前期工作已成功構(gòu)建含有4種真核表達(dá)載體的CHO細(xì)胞,即CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57。將上述細(xì)胞分別復(fù)蘇后,在96孔板中單克隆化,待細(xì)胞克隆長至孔底的1/4后,挑取細(xì)胞株置12孔板內(nèi)培養(yǎng)24h后,以800mg/

8、L的Zeocin加壓篩選。隨后的1個月中,每隔3～5天換液一次,維持Zeocin濃度為800mg/L。分別得到4、1、2、5株穩(wěn)定高效單克隆細(xì)胞株,ELISA檢測上清中目的蛋白濃度均達(dá)到1～2mg/L。RT-PCR分析表明,轉(zhuǎn)染4種MBL基因的CHO細(xì)胞均穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄mRNA。
　　 三、野生型和突變型MBL蛋白的純化及其生物學(xué)特性研究利用鼠抗人MBL-CRDmAb親和層析柱初步純化表達(dá)產(chǎn)物,Ni2+-NTAagarose層析柱進(jìn)一

9、步純化表達(dá)產(chǎn)物,獲得野生型和突變型重組MBL蛋白。在1L培養(yǎng)上清中均獲得1mg左右的目的蛋白。經(jīng)Westernblot和ELISA鑒定,純化后的蛋白產(chǎn)物可分別與抗MBL-CRD單克隆抗體、抗His單克隆抗體和抗MBL單克隆抗體結(jié)合。它們分別命名為野生型MBL蛋白和32Cys、34Asp、37Glu突變型MBL蛋白。通過SDS-PAGE和Westernblot分析,發(fā)現(xiàn)重組突變MBL蛋白以雙鏈(Mr約55000)為主,而重組野生型MBL分

10、子則以二至六聚體(Mr150000～450000)為主。結(jié)果表明,突變蛋白的多聚化程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型MBL蛋白。酵母菌凝集試驗(yàn)顯示:人血漿天然MBL和野生型MBL蛋白能結(jié)合酵母菌細(xì)胞壁甘露聚糖,產(chǎn)生可見的凝集顆粒,3種突變型MBL蛋白凝集顆粒極少；配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明,只有天然MBL和重組野生型MBL蛋白才能與甘露聚糖有效結(jié)合,3種突變型MBL,蛋白與糖結(jié)合的功能低下；補(bǔ)體C4d沉積試驗(yàn)顯示,3種突變型MBL蛋白不能通過凝集素途徑激活補(bǔ)體系