MGF遺傳重構(gòu)CHO細胞提高應(yīng)激耐受力的研究.pdf

1、以哺乳動物細胞為宿主,反應(yīng)器培養(yǎng)進行重組蛋白藥物的生產(chǎn),已經(jīng)成為生物制藥的主要技術(shù),目前國際上已有80％以上的重組蛋白藥物通過哺乳動物細胞表達。相比細菌和酵母菌,哺乳動物細胞對各種應(yīng)激環(huán)境的耐受力差,對培養(yǎng)環(huán)境的嚴格要求限制了大規(guī)模培養(yǎng),提高了生產(chǎn)成本。在對細胞增殖、凋亡、代謝等機理認識的基礎(chǔ)上,找到合適的靶點對細胞進行遺傳改造,使其更適合工業(yè)化培養(yǎng),是生物工程的重要研究內(nèi)容。結(jié)合本實驗室以往的研究,以及文獻報道,我們推測應(yīng)激響應(yīng)分子—

2、MGF有望作為提高宿主細胞應(yīng)激耐受力的靶點得到利用。本研究利用MGF基因遺傳重構(gòu)了CHO-K1宿主細胞,并評價了重組細胞對多種應(yīng)激環(huán)境的耐受能力,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1. PCR擴增MGF表達序列 BamHI和AscI雙酶切插入含GFP標簽的慢病毒pLenti6.3_MCS質(zhì)粒,構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒pL-GFP-MGF。鑒定序列正確的基礎(chǔ)上與包裝質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化293T細胞,包裝獲得重組病毒LV-MGF和空病毒LV-null

3、。高速梯度離心獲得純化病毒,滴度達到1.25×108和2×107。
　　2. Polybrene介導(dǎo)病毒MOI值為5感染CHO-K1細胞,獲得50％以上的感染率,在8μg/ml blasticidin選擇壓力下,持續(xù)培養(yǎng)2周,篩選獲得穩(wěn)定克隆。Western blot實驗證實所篩選的克隆株能高水平表達MGF,命名CHO-MGF,空病毒感染株命名為CHO-null;
　　3.分別模擬無血清培養(yǎng)基、消耗過培養(yǎng)基和酸堿培養(yǎng)基進行細

4、胞培養(yǎng),從細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡和細胞活力以及葡萄糖與乳酸代謝角度評價CHO-MGF、CHO-null以及親本細胞 CHO-K1對三種應(yīng)激環(huán)境的耐受力:
　　(1)在無血清的培養(yǎng)環(huán)境下,MTT實驗與細胞周期結(jié)果顯示,CHO-MGF較CHO-null、CHO-K1細胞具有更高的增殖能力;經(jīng)過48h的無血清培養(yǎng),流式細胞儀與臺盼藍拒染實驗分別測定三種細胞的凋亡率與細胞存活率,結(jié)果顯示, MGF能夠提高CHO-K1細胞的無血清耐受

5、力;使用SBA生物傳感分析儀,測定經(jīng)過三種細胞消耗過培養(yǎng)基中葡萄糖與乳酸的濃度,間接地證明了,CHO-MGF具有比較高的增殖速度,同時,也意味著重組力生長因子能夠提高 CHO-K1細胞的乳酸適應(yīng)力;
　　(2)通過培養(yǎng)CHO-K1細胞的方式制備了模擬哺乳動物分批培養(yǎng)后期營養(yǎng)物質(zhì)消耗的培養(yǎng)環(huán)境(Spent medium);通過MTT實驗、流式細胞儀測定細胞周期實驗測定三種細胞的增殖能力,結(jié)果顯示,CHO-MGF細胞較 CHO-nul

6、l、CHO-K1細胞在營養(yǎng)物質(zhì)消耗的培養(yǎng)條件下有更高的增殖能力,另外,葡萄糖濃度測定結(jié)果也證明了重組表達MGF能提高;通過流式細胞儀分析細胞凋亡與臺盼藍拒染實驗測定細胞存活率,證明重組MGF能提高宿主細胞對營養(yǎng)物質(zhì)消耗培養(yǎng)環(huán)境的抗凋亡能力;乳酸濃度測定實驗表明CHO-MGF細胞較CHO-null和CHO-K1細胞具有更強的乳酸耐受力;
　　(3)通過MTT實驗制備了模擬哺乳動物宿主細胞的酸堿培養(yǎng)環(huán)境;MTT實驗和流式細胞儀測定細胞

7、周期實驗顯示CHO-MGF細胞較CHO-null、CHO-K1細胞具有更高的增殖能力,葡萄糖濃度測定實驗也間接地證明了重組MGF能提高哺乳動物宿主細胞的增殖速度;流式細胞儀測定細胞凋亡實驗表明,過表達MGF能提高哺乳動物宿主細胞酸堿培養(yǎng)環(huán)境的抗凋亡能力,臺盼藍拒染實驗也證明了這一結(jié)論。
　　綜上所述,本研究以慢病毒為載體,構(gòu)建了穩(wěn)定表達MGF的CHO-K1細胞株,與對照組細胞相比,該重組細胞能更好的適應(yīng)無血清培養(yǎng)、spend-me