ERO1αDNA甲基化在高同型半胱氨酸血癥致肝臟脂代謝紊亂中作用的研究.pdf

1、目的:探討HHcy與脂代謝相關(guān)基因ERO1αmRNA和蛋白表達(dá)的改變，以及ERO1αDNA甲基化在引起ApoE-/-鼠肝臟脂代謝紊亂形成過程中的作用，明確HHcy在ApoE-/-鼠脂代謝紊亂形成中對ERO1α表達(dá)及其DNA甲基化調(diào)控的影響。
　　方法:采用油紅O染色法檢測各組小鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況，酶標(biāo)儀檢測各組小鼠肝臟內(nèi)TC和TG含量的變化，采用熒光定量PCR（RT-PCR）和Western blot法檢測ERO1αmRNA和蛋白

2、的表達(dá)；采用巢式降落式PCR（ntMS-PCR）法檢測ERO1α基因DNA甲基化改變，以ELISA法測各組小鼠肝臟內(nèi)DNMT1含量的變化。構(gòu)建ERO1α和DNMT1的重組表達(dá)質(zhì)粒及siRNA并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，以RT-PCR法測ERO1α和DNMT1的mRNA表達(dá)的變化，以Western blot測ERO1α和DNMT1蛋白表達(dá)的變化，以巢式降落式PCR測ERO1α基因甲基化修飾狀態(tài)的改變。
　　結(jié)果:HHcy組小鼠肝臟脂質(zhì)面積和血脂水

3、平顯著高于對照組與干預(yù)組（P<0.01），與對照組比較，其肝臟脂質(zhì)面積和血脂TC、TG分別升高約4.53、2.21、2.86倍，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TC與其血清Hcy水平呈正相關(guān)（r2=0.1029，P<0.01），TG與血清Hcy水平呈正相關(guān)（r2=0.1216，P<0.05）。
　　熒光RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，ApoE-/-對照組、HHcy組和干預(yù)組ERO1α的表達(dá)分別下降至76.66％，20.43％和40.14％

4、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。干預(yù)組與HHcy組相比，ERO1α表達(dá)升高1.96倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示Hcy對ERO1α蛋白表達(dá)與對mRNA表達(dá)的影響是一致的。細(xì)胞水平上，與對照組比較，用50，100，200，500μmol/L Hcy刺激細(xì)胞，ERO1α的mRNA表達(dá)分別下降至90.37％，55.44％，46.88％，36.93％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），葉酸治療組與

5、100μmol/L Hcy組比較，ERO1α的mRNA表達(dá)升高1.81倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示Hcy對ERO1α蛋白表達(dá)與對mRNA表達(dá)的影響一致。
　　構(gòu)建ERO1α的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后檢測ERO1α的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，EGFP-N1組ERO1α的mRNA水平無明顯變化，而EGFP-N1-ERO1α組的mRNA水平增加至1.33倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

6、P<0.01），Western blot檢測結(jié)果顯示ERO1α蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)一致。構(gòu)建針對ERO1α的干擾片段（siRNA1，siRNA2，siRNA3）并分別轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，檢測ERO1α的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，各組ERO1α的mRNA水平分別降至61.06％，38.70％和69.41％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中siRNA2干擾效果最顯著，Western blot檢測結(jié)果顯示ERO1α蛋白表達(dá)與

7、mRN A表達(dá)一致。細(xì)胞內(nèi)TC和TG檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Hcy+EGFP-N1-ERO1α組分別下降至51.52％（P<0.05）和60.89％（P<0.01），而同時(shí)siRNA2組分別增加至1.39倍（P<0.05）和1.88倍（P<0.01）。
　　啟動子活性分析的結(jié)果顯示，人類ERO1α的核心啟動子存在活性，-1~-1100bp段的啟動活性最強(qiáng)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，ntMS-PCR法檢測ER

8、O1α基因啟動子區(qū)DNA甲基化，結(jié)果表明，與對照組相比，HHcy組和治療組的ERO1α基因啟動子區(qū)DNA甲基化程度分別提高1.65倍和1.42倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，干預(yù)組可以與HHcy組相比，ERO1α基因啟動子區(qū)DNA甲基化程度下降至86.13％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01)。
　　構(gòu)建DNMT1的重組質(zhì)粒及針對DNMT1的siRNA并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，檢測DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組比較，E

9、GFP-N1-DNMT1組DNMT1的mRNA的表達(dá)增加至1.55倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），siRNA組DNMT1的mRNA的表達(dá)下降至26.70％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且Western blot檢測結(jié)果顯示ERO1α蛋白表達(dá)與mRN A表達(dá)一致。檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞ERO1α甲基化水平，結(jié)果顯示，與對照組比較，EGFP-N1-DNMT1的ERO1α甲基化水平增加至1.31倍，siRNA組下降至72.34%，差異