芳香烴受體-CD36信號路徑在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪變性中的作用研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝臟疾病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是目前備受關(guān)注的一種疾病狀態(tài)，由非酒精因素引起,以肝臟內(nèi)脂肪堆積為特征，包含了一系列組織學(xué)改變，包括肝臟脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。肥胖、2型糖尿病、高脂血癥等是NAFLD的重要危險因素,但NAFLD的發(fā)病機(jī)理仍不十分明確。同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)是蛋氨酸在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的含硫氨基酸，臨床上血

2、漿同型半胱氨酸濃度升高(>15μM)稱為高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia, HHcy）。HHcy是心血管疾病、糖尿病、免疫性以及神經(jīng)退行性疾病的重要危險因素。近年來的研究表明，HHcy與NAFLD的發(fā)病也密切相關(guān)。NAFLD病人血漿Hcy的水平高于正常對照人群；高蛋氨酸飲食（High-methionine diet,HMD）喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)HHcy的同時伴有肝臟的脂質(zhì)沉積。在不同HHcy模型中，已發(fā)現(xiàn)HHcy可致

3、肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，但具體致病機(jī)制仍不明確。本課題旨在進(jìn)一步闡明HHcy誘發(fā)肝臟脂肪變性的分子機(jī)制，以期為減輕HHcy引發(fā)的脂肪肝疾病提供新的治療思路和潛在靶點(diǎn)。
　　我們首先用2％（wt/wt）的HMD分別喂養(yǎng)6周齡C57BL/6雄性小鼠4周和8周建立HHcy模型，發(fā)現(xiàn)血漿Hcy的水平顯著增加。肝臟油紅O染色和肝臟脂質(zhì)抽提結(jié)果表明，與正常飲食組相比，HMD喂養(yǎng)的小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積。為了明確HHcy引起肝臟脂肪變性的具體機(jī)制

4、，我們檢測了肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，其中參與脂肪酸(Fatty acid, FA)攝取的關(guān)鍵基因清道夫受體CD36的mRNA和蛋白質(zhì)水平在4周 HMD喂養(yǎng)時顯著增加并持續(xù)至8周。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予原代肝細(xì)胞Hcy處理24小時可在誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的同時上調(diào)肝細(xì)胞CD36的表達(dá)。而CD36作為肝細(xì)胞對FA攝取的重要膜受體，參與了肝細(xì)胞對長鏈FA的攝取。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Hcy可增加小鼠原代肝細(xì)胞對長鏈FA的攝取，siRNA敲減原代肝細(xì)

5、胞中CD36的表達(dá)則改善Hcy所致肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積及FA攝取增加，以上結(jié)果表明CD36是HHcy引發(fā)肝臟脂肪變性的早期反應(yīng)因子。有關(guān)CD36表達(dá)調(diào)控的研究顯示，CD36是多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶點(diǎn)。為了明確HHcy引起CD36表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，我們篩選了參與CD36表達(dá)調(diào)控并且和肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因的表達(dá)。其中，芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)靶基因(Cyp1a1,Cyp1a2, CD

6、36)的表達(dá)在HMD喂養(yǎng)4周和8周均明顯增加。此外，在原代肝細(xì)胞中用siRNA敲減AHR及其靶基因的表達(dá)或使用AHR拮抗劑CH223191抑制AHR的活性，均可明顯抑制Hcy誘導(dǎo)的CD36表達(dá)上調(diào)、肝細(xì)胞FA攝取增加和脂質(zhì)聚積，表明AHR的激活參與了Hcy誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和CD36表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)AHR可通過上調(diào)CD36的表達(dá)誘發(fā)肝臟的脂肪變性。本研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí) Hcy促進(jìn)了 AHR與 CD36啟動子區(qū)域的結(jié)合；熒

7、光素酶報告基因檢測顯示Hcy增加了AHR反應(yīng)元件的活性，并且此過程是由內(nèi)源性配體所介導(dǎo)。
　　核受體AHR是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。多種花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)的代謝產(chǎn)物已被證實(shí)是AHR的內(nèi)源性配體。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明HHcy參與調(diào)節(jié)了AA代謝通路關(guān)鍵酶的活性。采用AA靶向代謝組學(xué)的方法分析發(fā)現(xiàn)脂氧化酶通路的代謝產(chǎn)物L(fēng)XA4的水平顯著增加，而LXA4是已知的AHR內(nèi)源性配體。對參與LXA4生物合成和

8、代謝失活基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，HMD顯著下調(diào)了LXA4代謝失活酶15-前列腺素氧化13-還原酶1的表達(dá)，提示LXA4含量的增加可能由于LXA4的代謝失活被抑制。為了明確LXA4是否在Hcy誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積中發(fā)揮了重要作用，我們過表達(dá)15-前列腺素氧化13-還原酶1，發(fā)現(xiàn)其明顯抑制了Hcy誘導(dǎo)的CD36表達(dá)上調(diào)、FA攝取增加和脂質(zhì)沉積；瞬時轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明LXA4可與AHR的配體結(jié)合域結(jié)合，促進(jìn)AHR轉(zhuǎn)位入核，增加了AHR反應(yīng)元件的活性。給予

9、原代肝細(xì)胞LXA4處理上調(diào)了AHR靶基因Cyp1a1，Cyp1a2和CD36的表達(dá)，增加了肝細(xì)胞FA攝取和脂質(zhì)沉積，而siAHR則逆轉(zhuǎn)了LXA4的上述作用。因此，LXA4以配體依賴方式激活A(yù)HR-CD36信號路徑，參與Hcy致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的過程。
　　為了進(jìn)一步明確 AHR在 HHcy誘導(dǎo)肝臟脂肪變性中的關(guān)鍵作用，我們在HMD喂養(yǎng)C57BL/6小鼠的同時給予AHR拮抗劑CH223191（10mg/kg/day飲水)分別喂養(yǎng)4周

10、和8周，CH223191明顯減輕了HMD喂養(yǎng)引起的肝臟脂質(zhì)沉積，同時抑制了肝臟中AHR靶基因Cyp1a1, Cyp1a2和CD36的mRNA表達(dá)。這些結(jié)果表明抑制AHR的活性可通過降低CD36的表達(dá)保護(hù)HMD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性。為了將動物實(shí)驗(yàn)與臨床研究相結(jié)合，我們對HHcy與NAFLD發(fā)病的相關(guān)性研究進(jìn)行了連續(xù)性變量的Meta分析，發(fā)現(xiàn)NAFLD病人血漿Hcy水平高于正常對照人群，說明HHcy是NAFLD發(fā)病的重要危險因素。