高同型半胱氨酸血癥經(jīng)NF-κB-DNMT1誘導ApoE---鼠MCP-1DNA低甲基化致動脈粥樣硬化的研究.pdf

1、目的：高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是動脈粥樣硬化的獨立危險因子,動脈粥樣硬化是一種以脂質(zhì)、纖維物質(zhì)和細胞碎片等聚集在血管壁為特征的復雜的炎癥性疾病,而趨化因子在其中發(fā)揮重要作用。單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)被認為是最重要和最具特征的趨化因子,其在正常動脈中不表達,而在動脈粥樣硬化損傷處表達增加。DNA甲基化可以解釋基因、環(huán)境和疾病之間的相互關(guān)系,是動脈粥樣硬化的早期診斷標志,同時可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。本實驗擬在ApoE-/-鼠上

2、,探討HHcy是否通過調(diào)節(jié)血液MCP-1DNA低甲基化,而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生,同時研究NF-κB/DNMT1在其機制中的作用。
　　方法：選用SPF級近交系C57BL/6J背景的5周齡雄性ApoE-/-小鼠為研究對象,適應環(huán)境一周后,將小鼠隨機分為4組:空白對照組、ApoE-/-對照組、高蛋氨酸組、葉酸和維生素B12干預組,飼養(yǎng)14周后處死,進行后續(xù)實驗。培養(yǎng)THP-1單核細胞,以4×106個接種于25cm×25cm培養(yǎng)瓶中,

3、加入PMA,使其終濃度為500nmol/L,37℃培養(yǎng)48小時,顯微鏡下觀察細胞貼壁狀態(tài),證實THP-1細胞已分化為巨噬細胞。棄去舊培養(yǎng)液,更換為含終濃度為50mg/L的ox-LDL和100μmol/LHcy的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,觀察泡沫細胞的形成,并用于后續(xù)實驗。實驗分為3組:對照組、泡沫細胞+100μmol/LHcy組(Con+100Hcy)、泡沫細胞+100μmol/LHcy+50μmol/LPDTC組(Con+

4、100Hcy+50PDTC)。采用主動脈病理切片HE染色,泡沫細胞油紅O染色,全自動生化分析儀檢測血清Hcy含量,巢式降落式甲基化特異性PCR(ntMS-PCR)檢測MCP-1DNA甲基化改變,酶聯(lián)免疫吸附法檢測MCP-1、DNMT1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB的含量,高效液相色譜法檢測血清SAH、SAM含量。
　　結(jié)果：
　　1.Hcy致小鼠血管壁損傷形態(tài)學變化及血清Hcy含量結(jié)果
　　與空白對照組比較,高蛋氨酸組小鼠主動脈管

5、壁可見大量動脈粥樣硬化樣物質(zhì),泡沫細胞和少量炎癥性細胞。葉酸和維生素B12干預組小鼠主動脈管壁病變較高蛋氨酸組有所緩解。高蛋氨酸組小鼠血清Hcy水平顯著增加,葉酸和維生素B12干預組血清Hcy水平較高蛋氨酸組降低(P<0.05)。由此表示,小鼠HHcy和動脈粥樣硬化雙模型建立成功。
　　2.小鼠血清SAM和SAH含量
　　與空白對照組比較,ApoE-/-對照組、高蛋氨酸組和干預組的血清中SAM含量分別增加3、3.6、2.45

6、倍(P<0.05),而尤以高蛋氨酸組血清SAM水平增加明顯。高蛋氨酸組血清SAH含量與空白對照組比較明顯增加(P<0.05)。
　　3.Hcy致小鼠MCP-1DNA低甲基化
　　與空白對照組比較,高蛋氨酸組MCP-1DNA發(fā)生明顯低甲基化(P<0.05)。MCP-1DNA低甲基化水平與動脈粥樣硬化損傷面積兩者呈正相關(guān)(γ=0.5175,P<0.05)。
　　4.Hcy致血清MCP-1分泌增加
　　與空白對照組比較

7、,高蛋氨酸組血清MCP-1含量明顯增加(P<0.05)。
　　5.血清NF-κB和DNMT1含量
　　與空白對照組比較,高蛋氨酸組血清NF-κB含量明顯升高(P<0.05),而葉酸和維生素B12干預組與高蛋氨酸組比較,血清含量降低約2.9倍(P<0.01)。高蛋氨酸組血清DNMT1含量較空白對照組降低約20.8％(P<0.01),而葉酸和維生素B12干預組血清DNMT1含量較高蛋氨酸組輕微升高(P<0.05)。血清NF-κB

8、和DNMT1含量兩者呈負相關(guān)(γ=0.3394,P<0.05)。
　　6.泡沫細胞NF-κB和DNMT1含量
　　油紅O染色后顯微鏡下觀察可看到脂滴面積等于或大于細胞核的面積,呈紅色泡沫樣改變,細胞核呈藍色的泡沫細胞。
　　100μmol/LHcy組NF-κB含量與對照組比較顯著升高(P<0.01)。添加PDTC干預后泡沫細胞NF-κB含量與100μmol/LHcy組比較顯著降低(P<0.01)。而100μmol/LH