益腎活血膠囊對高同型半胱氨酸血癥所致兔動脈粥樣硬化相關(guān)炎癥因子表達調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、本研究以高蛋氨酸飲食誘導兔高Hcy血癥并制備AS動物模型，以降低血漿Hcy水平的常用藥物葉酸、VitB6、VitB12聯(lián)合治療作為陽性對照，通過對高Hcy血癥所致AS兔腹主動脈內(nèi)膜、中膜病理改變及超微結(jié)構(gòu)的觀察，以及應用熒光實時定量PCR和免疫組化技術(shù)檢測ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9mRNA及蛋白表達的改變，并用Western blot和免疫組化檢測NF-kB抑制因子-a蛋白表達及NF-κB核移位的變化，探討益腎活

2、血膠囊對Hcy所致血管壁炎癥的抑制作用，為其臨床防治高Hcy血癥及AS提供科學依據(jù)。 目的：觀察益腎活血膠囊對高Hcy血癥所致AS兔血漿Hcy水平、腹主動脈壁形態(tài)學及超微結(jié)構(gòu)的改變、血管壁炎癥因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9基因和蛋白表達的變化、以及對NF-κB活化的影響，探討益腎活血膠囊對高Hcy血癥及其所致AS的防治作用及機理。 方法： 1.試驗動物：2-3月齡、體重2.0-2.5 kg

3、雄性純種新西蘭兔。 2.建立模型：以充盈球囊損傷腹主動脈內(nèi)膜后，2％高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)動物5個月，建立高Hcy血癥及AS動物模型。 3.動物分組：將56只新西蘭兔隨機分為正常組、模型組、益腎活血膠囊預防組、益腎活血膠囊小劑量組、益腎活血膠囊中劑量組、益腎活血膠囊大劑量組、西藥對照組，共7組。 4.觀察指標：(1)高效液相色譜技術(shù)檢測各實驗組兔血漿Hcy濃度；(2)腹主動脈壁病理學觀察；(3)腹主動脈壁形態(tài)學指標檢測

4、：平均內(nèi)膜厚度、中膜厚度、內(nèi)膜面積、內(nèi)膜面積與中膜面積比；(4)透射電鏡觀察腹主動脈壁中膜平滑肌細胞超微結(jié)構(gòu)；(5)實時定量RT-PCR法檢測腹主動脈ICAM-1、MCP-1、FGF-β1和MMP-9的mRNA表達；(6)免疫組化法觀察ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9的蛋白表達；(7)NF-κB活化情況檢測：Westernblot檢測IκB-a蛋白表達及免疫組化法檢測NF-κB核表達情況。 結(jié)果： 1.

5、各實驗組兔血漿Hcy濃度變化與正常對照組相比，模型組兔血漿Hcy濃度明顯升高；各藥物處理組兔血漿Hcy濃度較模型組均有不同程度下降，其中預防組下降最為顯著，其次為大劑量組；預防組和大劑量組與西藥對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義；小劑量組和中劑量組與西藥對照組相比差異無顯著性。 2.腹主動脈壁切片光鏡下HE染色觀察正常對照組兔腹主動脈血管壁內(nèi)膜、中膜、外膜三層結(jié)構(gòu)明顯，內(nèi)膜完整、無增厚，內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積，中膜VSMCs細長呈梭形，細

6、胞核藍染，同心圓狀排列整齊；模型組兔腹主動脈壁內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮下可見泡沫細胞聚集，中膜VSMCs排列紊亂，單位面積細胞核數(shù)量增多；預防組及各藥物治療組兔腹主動脈內(nèi)膜增厚與模型組相比均有所減輕，中膜VSMCs排列欠規(guī)則，單位面積細胞核數(shù)目略增多。 3.腹主動脈形態(tài)學指標比較3.1內(nèi)膜厚度比較：與正常對照組相比，模型組兔腹主動脈IT明顯增加；與模型組相比，各藥物處理組腹主動脈IT均有不同程度下降，其中預防組和大劑量組下降尤為明顯，

7、但是西藥對照組和小劑量組IT與模型組相比，差異無顯著性；預防組和大劑量組IT與西藥對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。 3.2中膜厚度比較：與正常對照組相比，模型組及各藥物組兔腹主動脈MT雖有不同程度增加，但差異無顯著性。 3.3內(nèi)膜面積比較：與正常對照組相比，模型組兔腹主動脈IA明顯增加；與模型組相比，各藥物處理組IA均有所下降，其中預防組和大劑量組下降尤為明顯，然而西藥對照組IA與模型組相比，差異無顯著性；預防組IA與西

8、藥對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。 3.4內(nèi)膜與中膜面積比(IA/MA)：與正常對照組相比，模型組兔腹主動脈IA/MA顯著增加(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組兔腹主動脈IA/MA均明顯下降(P均＜0.05)；預防組、大劑量組與西藥對照組相比差異具有顯著性(P均＜0.05)。 4.腹主動脈壁中膜平滑肌細胞超微結(jié)構(gòu)改變正常組兔血管中膜平滑肌細胞呈紡錘形，密斑密體排列規(guī)則，肌絲含量豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無腫脹，呈典型

9、的收縮型細胞特征；模型組可見血管平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移，核固縮，肌絲減少，線粒體明顯腫脹，呈空泡狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和高爾基體等細胞器增多，呈明顯的合成型細胞特征；益腎活血膠囊不同處理組，中膜平滑肌細胞形態(tài)均有不同程度的改善，與模型組相比，線粒體腫脹減輕，密斑密體可見，肌絲含量增加，恢復收縮型細胞特征；西藥對照組平滑肌細胞形態(tài)改善不明顯。 5.腹主動脈壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9mRNA表達水平比較(1)

10、 ICAM-1mRNA表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁ICAM-1mRNA表達顯著升高(P＜0.01)；各藥物處理組ICAM-1 mRNA表達較模型組均有不同程度下降，其中預防組下降最為顯著(P＜0.01)，其次為大劑量組(P＜0.01)，小劑量組ICAM-1mRNA表達與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；預防組和大劑量組與西藥對照組相比差異具有顯著性(P均＜0.05)。 (2) MCP-1mRNA表達比較

11、：與正常對照組相比，模型組兔血管壁MCP-1mRNA表達顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MCP-1mRNA表達均顯著下降(P均＜0.05)；預防組、中劑量組和大劑量組與西藥對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。 (3) TGF-β1mRNA表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁TGF-β1mRNA表達顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組TGF-β1mRNA表達均明顯下降(P均＜0

12、.05)；預防組與西藥對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 (4) MMP-9mRNA表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁MMP-9mRNA表達明顯升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MMP-9mRNA表達均顯著下降(P均＜0.01)；預防組和大劑量組與西藥對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。 6.腹主動脈壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9蛋白表達水平比較(1)

13、 ICAM-1蛋白表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁ICAM-1蛋白表達顯著升高(P＜0.01)；小劑量組和西藥對照組兔ICAM-1蛋白表達與模型組相比，差異無顯著性(P＞0.05)，預防組、中劑量組和大劑量組則較模型組明顯下降(P均＜0.05)；預防組和大劑量組兔ICAM-1蛋白表達明顯低于西藥對照組，也顯著低于小劑量組(P均＜0.01)。 (2) MCP-1蛋白表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁MCP-1蛋白

14、表達顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MCP-1蛋白表達均明顯下降(P均＜0.01)；預防組和大劑量組與西藥對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 (3)TGF-β1蛋白表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁TGF-β1蛋白表達顯著升高(P＜0.01)；小劑量組、中劑量組和西藥對照組兔TGF-β1蛋白表達與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，預防組和大劑量組TGF-β1蛋白表達較模型組明顯下降(

15、P均＜0.01)，且分別顯著低于西藥對照組、小劑量組和中劑量組(P均＜0.05)。 (4)MMP-9蛋白表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁MMP-9蛋白表達顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MMP-9蛋白表達均有所下降(P均＜0.05)，其中以大劑量組下降最為顯著(P＜0.01)，其次為預防組(P＜0.01)；大劑量組和西藥對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 7.腹主動脈NF-kB活

16、化情況比較Western blot分析顯示，模型組兔血管壁IkB-a蛋白表達較正常對照組明顯減少(P＜0.01)，提示高Hcy血癥促進IκB-a蛋白的降解；與模型組相比，各藥物處理組IκB-a蛋白表達均有不同程度的升高，其中以大劑量組回升最為顯著(P＜0.01)，小劑量組IκB-a蛋白表達與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；大劑量組IκB-a蛋白表達與西藥對照組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。 免疫組化顯示，模型

17、組兔血管壁NF-κBp65核表達比例較正常對照組明顯增多(P＜0.01)，提示高Hcy血癥促進NF-κB的核移位；與模型組相比，各藥物處理組NF-κB p65核表達比例均有不同程度的下降，其中以預防組下降最為顯著(P＜0.01.)，其次為大劑量組(P＜0.01)；預防組NF-κB p65核表達比例與西藥對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.益腎活血膠囊能夠降低實驗兔血漿Hcy水平。 2.益腎