雌激素對(duì)大鼠咀嚼肌功能狀態(tài)影響的體外研究.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders，TMD)是口腔常見(jiàn)病，病因復(fù)雜，涉及到咀嚼肌、顳下頜關(guān)節(jié)以及各相關(guān)結(jié)構(gòu)。TMD的發(fā)病率女性高于男性，其嚴(yán)重程度與年齡有關(guān)。TMD多開(kāi)始于青春期，在生育年齡達(dá)到高峰。女性高發(fā)病率以及年齡分布特點(diǎn)提示雌激素可能與TMD的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。 雌激素的生物學(xué)效應(yīng)是通過(guò)受體(estrogen receptors，ER)介導(dǎo)的。研究表明顳下頜關(guān)節(jié)髁突、軟骨、關(guān)節(jié)盤(pán)、

2、關(guān)節(jié)囊中存在ER，因此雌激素可能對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育、改建重建及代謝產(chǎn)生影響。但是雌激素對(duì)于咀嚼肌功能狀態(tài)的作用還不十分清楚。咀嚼肌的功能與顳下頜關(guān)節(jié)的功能活動(dòng)及TMD的發(fā)病息息相關(guān)。咀嚼肌功能紊亂得不到及時(shí)治療，肌的紊亂可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)壓增加和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)間的摩擦，損傷關(guān)節(jié)組織，可能發(fā)展為結(jié)構(gòu)紊亂疾病及骨關(guān)節(jié)病，導(dǎo)致或加重關(guān)節(jié)損害。而如果及時(shí)阻斷病因循環(huán)中的肌功能紊亂環(huán)節(jié)，有可能減輕或阻止其它類型顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)展。 本研究

3、的目的就在于通過(guò)建立咀嚼肌成肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，研究成肌細(xì)胞中ER的表達(dá)以及不同濃度17β-雌二醇對(duì)咀嚼肌成肌細(xì)胞增殖、肌球蛋白重鏈mRNA轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響，試圖揭示雌激素對(duì)咀嚼肌特性和功能狀態(tài)的影響，從而探討雌激素在TMD咀嚼肌紊亂病中的作用。 為建立大鼠咀嚼肌成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，以機(jī)械分離加酶消化法從5-7天SD大鼠頜面部獲取成肌細(xì)胞，以差速貼壁法純化細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，建立生長(zhǎng)曲線，以免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定獲

4、得的細(xì)胞。結(jié)果表明培養(yǎng)的成肌細(xì)胞結(jié)蛋白(Desmin)染色陽(yáng)性，陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)大于95％，表明獲得的成肌細(xì)胞純度較高。所以本實(shí)驗(yàn)所建立的大鼠咀嚼肌成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 為觀察成肌細(xì)胞中ER的表達(dá)，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的17-β雌二醇，以免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)ER的表達(dá)。結(jié)果表明，ERα和ERβ在成肌細(xì)胞中都有表達(dá)，ERα的表達(dá)強(qiáng)于ERβ，ERα主要表達(dá)于細(xì)胞核，而ERβ主要表達(dá)于細(xì)胞漿。雌激素能上調(diào)E

5、Rα和ERβ的表達(dá)，在10<'10>～10<'-8>Smol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。因此，咀嚼肌成肌細(xì)胞能夠表達(dá)功能性雌激素受體，受體的表達(dá)受雌激素的調(diào)節(jié)；咀嚼肌可能是雌激素的靶組織。 為研究雌激素對(duì)咀嚼肌成肌細(xì)胞增殖的作用，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的17-β雌二醇，以<'3>H-TdR法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，除了在10<'-8>mol/L時(shí)有一波動(dòng)外，17-β雌二醇隨著濃度的增加都能降低成肌細(xì)胞<'3>H-TdR的

6、摻入率，呈劑量依賴性，在10<'-6>mol/L時(shí)作用最明顯。成肌細(xì)胞的增殖對(duì)于咀嚼肌的生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)重建有重要作用。因此，雌激素可能抑制咀嚼肌成肌細(xì)胞的增殖，從而影響咀嚼肌的功能。 為研究雌激素對(duì)咀嚼肌成肌細(xì)胞肌球蛋白重鏈亞型mRNA表達(dá)的影響，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的17-β雌二醇，以熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示雌激素能明顯上調(diào)MHC Ⅰ mRNA的表達(dá)，對(duì)MHC Ⅱb mRNA的表達(dá)有明顯下調(diào)

7、作用。雌激素對(duì)MHC Ⅱ a和Ⅱ x的作用不明顯。MHC亞型表達(dá)的不同決定著肌肉不同的收縮特性。因此雌激素能調(diào)節(jié)咀嚼肌成肌細(xì)胞MHC亞型mRNA的表達(dá)，從而可能影響咀嚼肌的功能特性。 為研究雌激素對(duì)咀嚼肌成肌細(xì)胞胞漿鈣離子的影響，以酸刺激模擬咀嚼肌疲勞狀態(tài)，以Fluo-4-AM對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子染色，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察一段時(shí)間內(nèi)靜息狀態(tài)下以及酸性刺激下雌激素對(duì)咀嚼肌細(xì)胞胞漿Ca<'2+>濃度的影響。結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)下，加

8、入10<'-9>mol/L、10<'-8>mol/L和10<'-7>mol/L的17 β-雌二醇后使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，隨即迅速下降并在與靜息狀態(tài)胞漿鈣離子濃度相當(dāng)?shù)乃缴现匦滦纬蓜?dòng)態(tài)平衡；酸刺激時(shí)，加入10<'-9>mol/L、10<'-8>mol/L和10<'-7>mol/L的17 β-雌二醇后使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速降低，并在比原來(lái)低的水平上形成新的動(dòng)態(tài)平衡。胞漿鈣離子對(duì)維持細(xì)胞正常功能有重要作用，鈣離子蓄積是骨骼肌疲勞及損傷

9、的關(guān)鍵事件。因此，一定濃度的雌激素能夠使酸刺激下的咀嚼肌成肌細(xì)胞鈣離子濃度維持在較低的水平，從而減少胞漿鈣離子超載，維持咀嚼肌正常的功能。 總之，本研究成功培養(yǎng)了大鼠咀嚼肌成肌細(xì)胞，可以作為體外培養(yǎng)模型進(jìn)行相關(guān)研究。咀嚼肌成肌細(xì)胞中有雌激素受體的表達(dá)，咀嚼肌是雌激素的靶組織。雌激素能夠抑制成肌細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈亞型mRNA的表達(dá)，改變咀嚼肌的特性，并能減少酸刺激下成肌細(xì)胞胞漿鈣離子的蓄積。從結(jié)果看，雌激素對(duì)咀嚼肌的作用