骨髓間充質干細胞對內毒素致大鼠急性肺損傷生物學作用的實驗研究.pdf

1、目的： 嚴重感染膿毒血癥仍然是導致急性肺損傷最重要和常見的原因，目前尚缺乏十分有效的治療手段。本研究旨在觀察骨髓間充質干細胞(MSC)在脂多糖(LPS)誘發(fā)的大鼠急性肺損傷肺組織中的植入和分布，以及MSC對LPS致大鼠急性肺損傷的生物學作用和可能的機制，為干細胞治療急性肺損傷提供實驗線索。 方法和結果： 1．大鼠骨髓MSC的分離培養(yǎng)和鑒定 采用密度梯度離心和全骨髓貼壁分離法均能成功分離純化雄性大鼠骨髓MS

2、C，P4代細胞呈均一的長條形、梭形等成纖維細胞樣特征性形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞表面標志呈CD34-/CD45-/CD90+，并具有成骨、成脂肪分化潛能。 2．雄性MSC在雌性大鼠肺組織中的植入 制備雄性大鼠性別決定基因(Sry)探針，應用熒光原位雜交(FISH)技術觀察靜脈注入雄性MSC后，雄性MSC在雌性大鼠肺組織中的植入。結果顯示給予LPS和生理鹽水(NS)組沒有檢測到呈sry基因陽性的細胞，給予NS和MSC組僅在6

3、h和1d發(fā)現(xiàn)陽性細胞，給予LPS和MSC組直到3w仍有陽性細胞，陽性細胞存在于肺泡腔內側和間質，分布不均，損傷較重的部位更明顯，但陽性細胞總體比例不高(＜10％)。 3．MSC對靜脈注射LPS致大鼠急性肺損傷生物學作用的體內研究 65只雌性SPF級Wistar大鼠隨機分為①正常對照組(n=15)經尾靜脈注射等量NS，2h后經另一側尾靜脈注射雄性MSC，1×106/只；②肺損傷組(n=25)，經尾靜脈注射LPS8mg/kg

4、，2h后經另一側尾靜脈注射等量NS；⑦MSC干預組(n=25)，經尾靜脈注射LPS8mg/kg，2h后經另一側尾靜脈注射雄性MSC，1×106/只。每組在注射MSC后6h、24h、4d、1w和3w處死動物。結果顯示肺損傷組6hPaO267.1±11.6mmHg，較對照組顯著降低，肺組織病理表現(xiàn)為不同程度的充血和出血、肺泡破壞、間隔增寬、大量中性粒細胞聚集等表現(xiàn)，肺濕干比．BALF中總蛋白含量及肺組織MPO活性迅速升高，與正常對照組比較有

5、顯著差異(P＜0.01)；與肺損傷組比較，MSC干預組4d時對降低BALF中中性粒細胞數量．肺組織MPO活性和炎癥細胞浸潤程度評分有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，顯著降低了血清促炎因子TNF-α和IL-1β濃度(P＜0.05)，對血清抗炎因子IL-10的作用不顯著，有提高動物生存率和降低3w．點肺組織羥脯氨酸(HYP)含量的趨勢，但尚未達到統(tǒng)計學意義(P=0.22和P=0.09)。 4．MSC對腹腔注射LPS致大鼠急性炎癥性肺損傷

6、治療作用的體內研究 60只雌性SPF級Wistar大鼠隨機分為①空白對照組(n=20)經腹腔注射等量NS；②肺損傷組(n=20)，經腹腔注射LPS2mg/kg，1h后經尾靜脈注射等量NS；⑦MSC干預組(n=20)，經腹腔注射LPS2mg/kg，1h后經尾靜脈注射雄性MSC，1×106/只。每組在注射MSC后6h、24h、48h和2w處死動物。肺損傷組肺組織病理表現(xiàn)為血管充血和以中性粒細胞浸潤為主的細胞數量增多，6h時即出現(xiàn)，2

7、4h時最明顯，48h時炎癥較前減退，2w時肺組織基本恢復正常。MSC干預組6h時肺組織病理較肺損傷組輕，24h時繼續(xù)減輕，48h時肺組織基本恢復正常。與肺損傷組相比，MSC干預組顯著降低了肺濕干比、BALF中總蛋白含量及肺組織中中性粒細胞數量(P＜0.05)，而且顯著降低了血清促炎因子TNF-α、IL-1β和MIP-1α濃度(P＜0.01)，但對抗炎因子IL-10的升高作用尚未達到統(tǒng)計學意義(P=0.21)。 5．MSC與LPS

8、損傷的肺部細胞相互作用的體外研究 首先分離培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細胞(AM)、肺微血管內皮細胞(EC)和肺細胞(LC)． (1)MSC與LPS損傷AM的相互作用 采用膜孔徑0.4um的Transwell小室，分為①MSC單獨培養(yǎng)組②AM單獨培養(yǎng)組③MSC和AM直接共培養(yǎng)組④MSC和AM間接共培養(yǎng)組，分別以LPS損傷4h后，MSC和AM直接共培養(yǎng)組和間接共培養(yǎng)組均較AM單獨培養(yǎng)組顯著降低了培養(yǎng)液上清促炎因子TNF-α，I

9、L-1β和MIP-1α濃度(P＜0.05或0.01)，直接共培養(yǎng)組作用更顯著，對MIP-1α的降低作用與間接共培養(yǎng)組比較P＜0.05，并且升高了抗炎因子IL-10濃度，與AM單獨培養(yǎng)組比較P＜0.05． (2)MSC與LPS損傷肺部細胞的相互作用--MSC的體外遷移 采用膜孔徑3um的Transwell小室，上室接種MSC，下室分別接種AM、AM+EC和LC，分為實驗組和空白對照組，實驗組給予LPS損傷，共培養(yǎng)3d后，實

10、驗組MSC遷移細胞數均較空白對照組明顯增多(P＜0.01)，遷移細胞的形態(tài)無變化，AM+EC組遷移細胞Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色呈陰性。 結論： 1、骨髓MSC可成功分離純化，并在體外穩(wěn)定培養(yǎng)。 2、骨髓MSC不僅在體內能向損傷肺組織歸巢，抑制LPS誘導的局部和全身炎癥反應，進而發(fā)揮對急性炎癥性肺損傷的治療作用，而且，在體外也能向受損肺部細胞遷移，影響局部細胞因子的產生，并且這種作用除了直接接觸的機制外，還可能通