KGF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療內(nèi)毒素致小鼠急性肺損傷及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDs)是各種致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭，其最常見(jiàn)的致病因素為肺部感染。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)ARDS的治療進(jìn)行了大量的研究并取得了一定的進(jìn)展，但并不能從根本上改善不良預(yù)后，其死亡率仍高達(dá)40％。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells

2、，MSCs)作為一種多潛能干細(xì)胞，取材方便，易于分離擴(kuò)增，且能免疫耐受并能轉(zhuǎn)染和長(zhǎng)期表達(dá)外源性基因，是理想的組織修復(fù)來(lái)源和基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定載體，因而其在ARDS/ALl治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor，KGF)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)家族的第7位成員，具有促進(jìn)上皮細(xì)胞有絲分裂、調(diào)控細(xì)胞分化、抗凋亡及促進(jìn)表面活

3、性物質(zhì)結(jié)合蛋白(surfactant-associatedprotein，SP)的合成等作用，在ALI的治療研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本研究旨在觀察KGF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞回輸體內(nèi)對(duì)內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)所致的肺損傷模型的生物學(xué)作用并探討其相關(guān)的機(jī)制，為ALI的治療提供一種新的具有突破性的實(shí)驗(yàn)線索。
　　方法和結(jié)果
　　采用全骨髓貼壁法分離MSCs，培養(yǎng)和擴(kuò)增至第四代，經(jīng)流式細(xì)

4、胞儀和分化鑒定，得到純度較高的MSCs。同時(shí)構(gòu)建KGF重組質(zhì)粒感染293T細(xì)胞，濃縮純化后收集病毒顆粒，再分別感染小鼠MSCs，熒光顯微鏡觀察兩組感染效率均達(dá)90％，經(jīng)real-time定量PCR法和western-blot法分析KGF基因表達(dá)良好。經(jīng)小鼠氣管內(nèi)滴注LPS10 mg/kg成功構(gòu)建ALI模型后，160只ALI模型小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(NS組)、單純MSCs對(duì)照組(MSCs組)、MSCs空載對(duì)照組(MSCs-vec組)

5、和攜帶KGF的MSCs實(shí)驗(yàn)組(MSCs-KGF組)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，MSCs可定植于肺組織內(nèi)；在24h和3d時(shí)間點(diǎn)，MSCs-KGF實(shí)驗(yàn)組KGF的RNA和蛋白質(zhì)在體內(nèi)表達(dá)明顯增高(P<0.05)，同時(shí)對(duì)降低肺濕干比、BALF中總蛋白含量、BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量及肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且顯著降低了BALF中促炎因子水平而升高了抗炎因子水平。MSCs-KGF實(shí)驗(yàn)組肺組織病理切片的病變程度輕

6、于對(duì)照組，病理評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另取40只小鼠隨機(jī)分為上述4組單獨(dú)測(cè)生存率，結(jié)果提示其對(duì)改善生存率有一定優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。同時(shí)MSCs-KGF實(shí)驗(yàn)組SPB和SPC的mRNA水平與對(duì)照組比較明顯增加(P<0.05)，免疫組化示MSCs-KGF實(shí)驗(yàn)組PCNA陽(yáng)性的細(xì)胞較對(duì)照組增多。
　　結(jié)論：
　　1.運(yùn)用全骨髓貼壁法能成功從小鼠骨髓中分離MSCs，并可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增。
　　2.KGF慢病毒載體能感染M

7、SCs，并能高效率、長(zhǎng)時(shí)間在MSCs內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)KGF，MSCs是良好的基因治療運(yùn)載工具。
　　3.KGF基因修飾的MSCs移植后可歸巢到受損肺組織，并能在肺內(nèi)高表達(dá)KGF；
　　4.KGF與MSCs發(fā)揮協(xié)同作用，可改善肺血管滲透性，抑制肺組織的炎癥反應(yīng)，減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷病變嚴(yán)重程度，并且具有提高ALI動(dòng)物生存率的趨勢(shì)，從而為ALI的基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　5.KGF發(fā)揮作用的潛在機(jī)制可能與KGF刺激SP