刺五加注射液對(duì)豚鼠慶大霉素耳毒性拮抗作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、氨基甙類抗生素(aminoglycosideantibiotics，AmAn)具有抗菌譜廣、價(jià)格便宜及使用方便等優(yōu)點(diǎn)，成為廣泛使用的抗生素品種之一。盡管AmAn具有許多適于臨床應(yīng)用的特點(diǎn)，但是其不良反應(yīng)也不容忽視，其中最嚴(yán)重的副作用是腎毒性和耳毒性。AmAn藥物耳毒性發(fā)病率高，而且一旦發(fā)生慢性損傷，則大多數(shù)為不可逆，嚴(yán)重者甚至可引起失聽(tīng)，這些都嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。為此，了解氨基甙類抗生素耳毒性發(fā)病機(jī)制，為防治其不良反應(yīng)提供理論依據(jù)

2、勢(shì)在必行。氨基甙類抗生素耳毒性的機(jī)制可能與氨基甙類抗生素在內(nèi)耳的積蓄作用；自由基損傷；細(xì)胞凋亡；第二信使作用；mtDNA基因突變及體內(nèi)某些金屬離子有關(guān)等。 刺五加注射液(acanthopanaxsenticosus，ASS)系刺五加的莖葉用常規(guī)方法制成的滅菌溶液，是臨床上常用的活血化淤藥。通過(guò)大量的研究和實(shí)驗(yàn)，人們對(duì)刺五加的活性物質(zhì)及其藥理作用做了深入研究，表明刺五加可增強(qiáng)機(jī)體非特異性防御能力，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗

3、輻射及抗疲勞等作用外，ASS還可擴(kuò)張血管、增加冠狀動(dòng)脈回流量、減少心肌耗氧量、改善血液循環(huán)、消除自由基對(duì)組織的損害等廣泛的藥理作用，常用于治療心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱等癥。但用該注射液治療氨基甙類抗生素所致耳毒性損傷的研究國(guó)內(nèi)外卻未見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)ASS的上述藥理作用，我們推測(cè)ASS可擴(kuò)張耳蝸血管，增加耳蝸血流量，改善內(nèi)耳微循環(huán)，清除自由基，增強(qiáng)耳蝸對(duì)缺血缺氧的耐受能力等。本研究主要目的就是觀察ASS是否對(duì)慶大霉素所致豚鼠耳毒性具有拮

4、抗作用并探討其機(jī)制，為臨床應(yīng)用其治療AmAn耳毒性提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及耳毒性模型制備選用耳廓反應(yīng)靈敏的健康白色紅目豚鼠，體重約為200～250g，雌雄不拘。將豚鼠隨機(jī)分成將豚鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、慶大霉素(gentamicin，GM)組、ASS+GM組和ASS組。GM組每日腹腔注射GM注射液100mg/kg；ASS+GM組每日腹腔注射刺五加注射液200mg/kg，同時(shí)腹腔注射與GM組等量的GM注射液

5、；ASS組每日腹腔注射與ASS+GM組等量的ASS；對(duì)照組每日腹腔注射生理鹽水2.5ml/kg。各組動(dòng)物皆連續(xù)用藥10d混合飼養(yǎng)，每日測(cè)量體重調(diào)整藥量。 二、ABR閾值檢測(cè)在用藥前和停藥后處死前，將各組動(dòng)物用1％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉。用主頻率為2kHz的短聲刺激信號(hào)，耳機(jī)距豚鼠外耳道約0.5cm左右，記錄電極置顱頂正中，參考電極及接地電極分別置于給聲耳及對(duì)側(cè)耳后乳突部皮下，以DAT-100行疊加儀進(jìn)行疊加200次

6、，以VC-10示波器輸出信號(hào)，觀察時(shí)程為20ms，測(cè)試強(qiáng)度由95dBnHL開(kāi)始，聽(tīng)閾判斷以P3波為主。 三、耳蝸標(biāo)本的制備及檢測(cè)技術(shù) 1.SABC免疫組化及原位末端標(biāo)記法(Tunel)：將各組動(dòng)物快速斷頭處死取聽(tīng)泡，充分暴露耳蝸。在解剖顯微鏡下開(kāi)放卵圓窗和圓窗，用微量注射器緩慢注入含4％多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸緩沖液(PBS)，再將標(biāo)本置于上述固定液中4℃下固定2小時(shí)。PBS沖洗后，放入10％EDTA中4℃下脫鈣

7、10d.再移入含25％蔗糖的PBS中4℃過(guò)夜。常規(guī)石蠟包埋，平行于蝸軸方向連續(xù)切片.進(jìn)行常規(guī)HE染色，免疫組化法測(cè)定耳蝸組織中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、谷氨酸(glutamate，Glu)的表達(dá)，Tunel法檢測(cè)耳蝸細(xì)胞的凋亡情況。 2.電鏡標(biāo)本制備：豚鼠斷頭處死，速取聽(tīng)泡，充分暴露耳蝸，將耳蝸迅速浸入2.5％戊二醛固定液中。在解剖顯微鏡下開(kāi)放卵圓窗和圓窗，在蝸尖鉆孔緩慢注入2.5％戊二醛固定液，將標(biāo)本置于固定液中4℃4h

8、后，經(jīng)PBS沖洗后放入10％的EDTA中，4℃下脫鈣10d，再經(jīng)鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，制作超薄切片，透射電鏡下觀察。掃描電鏡標(biāo)本制備：步驟同前，但須進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，離子濺射真空鍍膜，掃描電鏡下觀察。 3.免疫印跡(Westernblot)法：快速斷頭處死取聽(tīng)泡，充分暴露耳蝸，將耳蝸置于0.9％生理鹽水中，下面放置冰塊，盡量去除骨組織，將兩只豚鼠耳蝸合用為一份，超聲粉碎，4℃離心，17500r/min2h，將其標(biāo)

9、準(zhǔn)化。蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，5％牛血清白蛋白封閉1h，兔抗多克隆抗體caspase-3抗體4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗后加入特異性標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，加入底物顯色。 4.耳蝸外毛細(xì)胞(OHCs)的分離：將動(dòng)物斷頭處死，迅速解剖取出雙側(cè)聽(tīng)泡，置于含無(wú)鈣細(xì)胞外液的平皿中，下面放置冰袋。在解剖顯微鏡下打開(kāi)聽(tīng)泡，盡量取出骨組織，將其放入含有0.5％胰酶的緩沖液(由無(wú)鈣細(xì)胞外液配制)中，30℃消化15min后，用無(wú)鈣細(xì)胞外液沖洗3次以終止

10、消化，再將蝸軸移人含有有鈣細(xì)胞外液的平皿中，解剖顯微鏡下用不銹鋼針將基底膜從蝸軸分離，然后吹打制得的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液分裝在24孔板上，每孔約1mL的體積，把24孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置10min，使細(xì)胞貼壁。Fluo-3的染色及鈣成像：每孔加入用二甲亞砜(DMSO)稀釋好的Fluo-3/AM0.5ul，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃避光孵育30min，孵育后用無(wú)鈣細(xì)胞外液沖洗3次以終止孵育，通過(guò)Metaflour4.5/coolsnapfx/

11、IX70顯微熒光測(cè)鈣系統(tǒng)檢測(cè)Glu和ASS引起的OHCs內(nèi)鈣濃度變化及Huo-3熒光強(qiáng)度變化。 四、圖像處理應(yīng)用顯微圖像分析技術(shù)對(duì)耳蝸各待測(cè)部位測(cè)量iNOS、谷氨酸的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物灰度值，分別計(jì)算各組各部位平均灰度值。原位凋亡的檢測(cè)：光鏡下可見(jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色，正常細(xì)胞核為藍(lán)色。Westernblot結(jié)果用GIS-700D凝膠圖像系統(tǒng)掃描分析。 五、統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)值均以-x±s表示，各組均值用t檢驗(yàn)。用SPSS軟件

12、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 一、ABR閾值檢測(cè)各組豚鼠用藥前ABR閾值無(wú)明顯變化。用藥后GM組ABR明顯升高，與對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.01)；ASS+GM組ABR閾值雖然也有所升高，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，而與GM組相比，差異顯著(P＜0.01)；用藥前后ASS組ABR閾值與對(duì)照組ABR閾值接近。 二、iNOS、谷氨酸免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果正常對(duì)照組和ASS組耳蝸iNOS表達(dá)陰性；GM組iNOS在柯蒂

13、氏器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)都有棕黃色顆粒沉著，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；ASS+GM組耳蝸的柯蒂氏器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)也有棕黃色顆粒沉著，但是著色程度明顯比GM組淺。Glu在正常對(duì)照組和ASS組耳蝸呈弱陽(yáng)性表達(dá)；GM組在柯蒂氏器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)都有Glu的棕黃色顆粒沉著，呈陽(yáng)性表達(dá)。 三、電鏡觀察耳蝸毛細(xì)胞情況透射及掃描電鏡結(jié)果均顯示GM組的毛細(xì)胞損傷明顯，而ASS+GM組的病理改變與GM組相比明顯減輕。 四、Westernbl

14、ot檢測(cè)caspase-3結(jié)果對(duì)照組和ASS組caspase-3略有表達(dá)；GM組caspase-3表達(dá)明顯增多；ASS+GM組caspase-3的表達(dá)與對(duì)照組和ASS組相比雖有所增多，但與GM組相比，表達(dá)明顯減少。 五、耳蝸細(xì)胞凋亡結(jié)果正常對(duì)照組、ASS+GM組和ASS組Corti器細(xì)胞均無(wú)凋亡；GM組Corti器有2個(gè)細(xì)胞發(fā)生凋亡。 六、ASS、Glu對(duì)OHCs內(nèi)鈣濃度的影響Glu能使OHCs內(nèi)鈣濃度升高，ASS能降低

15、Glu所引起的OHCs內(nèi)鈣濃度升高的幅度。 結(jié)論： 1.ASS可能通過(guò)抑制iNOS的表達(dá)，減輕NO增多造成的慶大霉素對(duì)耳蝸的損傷。 2.ASS可能通過(guò)降低caspase-3的表達(dá)來(lái)拮抗慶大霉素引起的耳蝸細(xì)胞凋亡。 3.應(yīng)用GM10d后，豚鼠耳蝸中谷氨酸樣免疫反應(yīng)增強(qiáng)，推測(cè)谷氨酸的過(guò)度釋放參與了GM耳毒性的發(fā)生。 4.ASS能明顯減低由Glu引起的單離豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度增加，提示ASS可降低