膜片鉗原位檢測(cè)HCN4基因修飾的MSCs移植至大鼠心臟后的細(xì)胞電生理變化.pdf

1、背景與目的：
　　電子心臟起搏器是目前臨床上有效治療緩慢性心律失常的常規(guī)方法,但存在費(fèi)用昂貴、電池壽命有限、起搏器缺乏對(duì)神經(jīng)激素的自動(dòng)反應(yīng)性等不足,且可能出現(xiàn)出血、感染等并發(fā)癥。近年來,隨著對(duì)起搏細(xì)胞離子通道基因的了解進(jìn)一步深入,利用生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù),對(duì)受損的心臟起搏點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)或替代,重建心臟“生物起搏點(diǎn)”,使心臟的起搏和傳導(dǎo)功能得以恢復(fù),已成為當(dāng)前心臟電生理學(xué)界研究的熱點(diǎn)。
　　起搏電流(currentfunny,If)

2、是竇房結(jié)細(xì)胞舒張期自動(dòng)除極化的主要決定因素,并在心率控制及神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)心率的調(diào)節(jié)中起重要作用;超極化激活的環(huán)化核苷酸門控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)通道基因家族編碼的HCN通道則是If形成的分子基礎(chǔ)。目前已有利用HCN基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植進(jìn)入房室傳導(dǎo)阻滯的動(dòng)物模型中成功創(chuàng)建生物起搏點(diǎn)的報(bào)道,

3、結(jié)果令人鼓舞,但有一些關(guān)鍵的問題仍亟待解決。首先,在體研究發(fā)現(xiàn)生物起搏的頻率低下(約40~50bpm,也有低至30bpm的情況),顯著低于與體外心肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的起搏頻率,是否起搏電流的特性發(fā)生了改變?具體原因尚不清楚;其次,MSCs具有多向分化的潛能,其移植到宿主心臟后,僅作為一個(gè)載體工具,還是分化為具備功能的心肌樣細(xì)胞發(fā)揮起搏作用?以上問題對(duì)于移植細(xì)胞能否在體內(nèi)穩(wěn)定、持久的發(fā)揮起搏功能至關(guān)重要。
　　然而,由于缺乏對(duì)移植細(xì)胞直

4、接進(jìn)行原位功能檢測(cè)的手段,目前多數(shù)研究主要是通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)移植細(xì)胞的表型變化,以及通過宏觀的心電圖、三維電解剖標(biāo)測(cè)系統(tǒng)(CARTO)等無創(chuàng)檢查對(duì)移植細(xì)胞的起搏功能進(jìn)行評(píng)估。但移植細(xì)胞表型的改變并不等同于具備了心肌細(xì)胞樣的功能;無創(chuàng)檢查的空間分辨力有限,不能對(duì)“體內(nèi)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞如何交互作用影響心臟功能”進(jìn)行精確描述。因此,目前的研究尚不能真正闡明移植細(xì)胞在宿主心臟中發(fā)揮起搏功能及起搏功能發(fā)生改變的機(jī)制。
　　眾所周知,起搏

5、電流(funnycurrent,If)是起搏細(xì)胞發(fā)揮功能的基礎(chǔ),而膜片鉗技術(shù)是檢測(cè)細(xì)胞膜離子通道電流的最根本、有效的方法。利用膜片鉗技術(shù)針對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行原位的電生理學(xué)研究,將有助于闡明起搏細(xì)胞的電生理學(xué)特性及其與宿主心肌細(xì)胞交互作用的機(jī)制。對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行原位膜片鉗檢測(cè)需要在組織切片上進(jìn)行,但目前尚未發(fā)現(xiàn)利用成年動(dòng)物心肌組織切片膜片鉗技術(shù)原位檢測(cè)移植干細(xì)胞電生理特性及其與宿主心肌細(xì)胞交互作用功能的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬利用組織片膜片鉗技術(shù),對(duì)同種

6、異體移植到宿主心臟中的mHCN4基因修飾的大鼠MSCs(HCN4-MSCs)進(jìn)行原位電生理學(xué)研究。
　　方法：
　　1.取健康SD大鼠骨髓,經(jīng)密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)獲得MSCs,在體外擴(kuò)增、純化。
　　2.構(gòu)建mHCN4的表達(dá)載體pLenti6.3-mHCN4-IRES2-EGFP(LV-HCN4-EGFP)及空載體pLenti6.3-IRES2-EGFP(LV-EGFP),分別轉(zhuǎn)染第三代的MSCs,5~7天后利用免疫

7、組化方法及膜片鉗方法檢測(cè)起搏離子通道蛋白及電流的表達(dá)。
　　3.將MSCs同種移植到SD大鼠心臟中創(chuàng)建細(xì)胞移植模型,在此基礎(chǔ)上建立適合于膜片鉗檢測(cè)的心肌組織切片方法。
　　4.將SD大鼠分為兩組(每組各10只):1)實(shí)驗(yàn)組移植轉(zhuǎn)染mHCN4的MSCs(HCN4-MSCs);2)體內(nèi)對(duì)照組移植僅轉(zhuǎn)染EGFP的MSCs。各組大鼠在細(xì)胞移植4周后處死,取心臟進(jìn)行切片,對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行原位的膜片鉗檢測(cè)。同時(shí),另設(shè)兩個(gè)組作為體外對(duì)照:1

8、)HCN4-MSCs體外培養(yǎng)1周組,2)HCN4-MSCs體外培養(yǎng)4周組。在本研究中,上述4組分別被定義如下:實(shí)驗(yàn)組,體內(nèi)對(duì)照組,體外對(duì)照組(1)及體外對(duì)照組(2)。利用膜片鉗技術(shù)對(duì)各組細(xì)胞的起搏電流(If)進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)各組細(xì)胞記錄到的If電流特性進(jìn)行比較和分析。并檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及體內(nèi)對(duì)照組移植細(xì)胞的動(dòng)作電位、鈉電流及鈣電流。
　　5.在全細(xì)胞膜片鉗封接的基礎(chǔ)上,結(jié)合熒光黃染料轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)移植細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞之間的縫隙連接

9、通訊功能。
　　6.膜片鉗檢測(cè)結(jié)束后,將心肌組織用4％多聚甲醛常規(guī)固定、石蠟包埋、切片,利用免疫熒光方法檢測(cè)移植細(xì)胞HCN4及EGFP蛋白的表達(dá);利用免疫組化的方法檢測(cè)縫隙連接蛋白43(connexin43,CX43)的表達(dá)及分布,以及移植區(qū)域IgG的表達(dá)及CD3+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)分離純化的MSCs高表達(dá)CD29和CD44抗原(高達(dá)99%以上),而CD34和CD45抗原表達(dá)與同型對(duì)照沒有顯著差

10、異;并且在特定的誘導(dǎo)條件下,MSCs可以分化為心肌樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞,證實(shí)其多向分化潛能。以上特性符合目前公認(rèn)的MSCs標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.在MOI=10的條件下,慢病毒對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到67.0±6.6%(n=5),MSCs形態(tài)及活性未受明顯影響。轉(zhuǎn)染“pLenti6.3-mHCN4-IRES2-EGFP”的MSCs同時(shí)表達(dá)EGFP及mHCN4蛋白,并記錄到可被4mMCsCl可逆性阻斷的超極化激活的內(nèi)向電流,證實(shí)為

11、起搏電流If;而轉(zhuǎn)染“pLenti6.3-IRES2-EGFP”的MSCs僅表達(dá)EGFP,未記錄到起搏電流If。
　　3.通過改良的心肌組織切片方法,獲得了活性良好、背景熒光低的心肌組織切片。在切片中,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、橫紋清晰可見;移植的MSCs呈簇狀分布在心肌細(xì)胞的縫隙之間,細(xì)胞呈類圓形、短梭形,形態(tài)完整、表面光滑,與心肌細(xì)胞緊密連接。在熒光條件下,心肌組織自發(fā)熒光背景較低,可以觀察到EGFP標(biāo)記的MSCs。通過全細(xì)胞膜片鉗方

12、式,分別記錄到了組織片中心肌細(xì)胞及移植的MSCs細(xì)胞的膜電流,證實(shí)細(xì)胞活性良好,完全能夠滿足針對(duì)移植MSCs進(jìn)行原位膜片鉗檢測(cè)的需要。
　　4.實(shí)驗(yàn)組移植的HCN4-MSCs在宿主心臟中能存活4周以上。實(shí)驗(yàn)組與體外對(duì)照組(1)及體外對(duì)照組(2)的HCN4-MSCs表達(dá)超極化激活的起搏電流(If)。體內(nèi)對(duì)照組的MSCs不表達(dá)If。
　　(1)實(shí)驗(yàn)組與體外對(duì)照組(1)及體外對(duì)照組(2)相比,三組間If電流幅值無顯著差異[分別為-

13、1007.4±132.3pA(n=14)、-1012.5±187.3pA(n=16)及-1025.5±200.9pA(n=15),P>0.05]。三組間細(xì)胞膜電容比較有顯著性差異(P值均<0.05),其中實(shí)驗(yàn)組(6.8±1.2pF,n=14)<體外對(duì)照組(1)(25.0±5.6pF,n=16)<體外對(duì)照組(2)(32.4±4.8pF,n=15)。三組間電流密度分別為-151.7±26.1pA/pF(n=14),-41.6±7.7pA/p

14、F(n=16)及-31.7±4.0pA/pF(n=15),差異亦達(dá)顯著性(P值均<0.05)。
　　(2)實(shí)驗(yàn)組If電流的激活閾電位為-46.7±5.9mV(n=20),明顯低于體外對(duì)照組(1)(-40.6±4.4mV,n=20)及體外對(duì)照組(2)(-41.3±5.2mV,n=22),P值均<0.05;而兩個(gè)體外對(duì)照組之間無顯著差異(P=0.181)。
　　(3)與體外對(duì)照組(1)及體外對(duì)照組(2)If電流的半激活電壓[分別

15、為-94.8±7.8mV,n=16;-96.4±6.6mV,n=15]相比,實(shí)驗(yàn)組If電流的半激活電壓(-107.8±14.6mV,n=14)分別負(fù)移了大約13mV及11mV,差異達(dá)到顯著性(P值均<0.05)。而兩個(gè)體外對(duì)照組之間無顯著差異(P=0.553)。
　　(4)實(shí)驗(yàn)組的If電流激活曲線的斜率為-13.7±1.7(n=14),與體外對(duì)照組(1)(-11.5±1.8,n=16)及體外對(duì)照組(2)(-11.2±2.2,n=1

16、5)相比,均達(dá)到顯著差異(P值均<0.05),而兩個(gè)體外對(duì)照組之間無顯著差異(P=0.717)。
　　(5)在指令電壓為-140mV時(shí),實(shí)驗(yàn)組If電流的激活時(shí)間常數(shù)為509.8±66.6ms(n=6),與體外對(duì)照組(1)(405.6±64.5ms,n=8)及體外對(duì)照組(2)(427.5±62.2ms,n=7)相比,有更緩慢激活的趨勢(shì),但三組之間的差異未達(dá)顯著性(P=0.051)。
　　(6)三組If電流的翻轉(zhuǎn)電位分別為實(shí)驗(yàn)組

17、-32.3±3.3(n=8),體外對(duì)照組(1)-29.5±3.9(n=11),體外對(duì)照組(2)-30.9±3.0(n=10),三者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　(7)3μM異丙腎上腺素能夠使實(shí)驗(yàn)組If電流激活曲線的半激活電壓正移約9.7mV(從-106.5±9.5mV到-96.8±8.7mV,n=4;P<0.05),但對(duì)激活曲線的斜率影響不明顯(從-12.8±2.1到-12.9±1.8,n=4;P>0.05)。
　

18、　5.在實(shí)驗(yàn)組、體內(nèi)對(duì)照組及兩個(gè)體外對(duì)照組中,均未能在MSCs上記錄到去極化激活的內(nèi)向INa或ICa-L電流,亦未能記錄到動(dòng)作電位。在膜片鉗全細(xì)胞記錄模式的基礎(chǔ)上進(jìn)行的熒光染料轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中,未發(fā)現(xiàn)熒光素黃染料從被檢測(cè)的HCN4-MSCs(n=6)擴(kuò)散到周圍的心肌細(xì)胞中。
　　6.免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,只有極少數(shù)的移植HCN4-MSCs表達(dá)CX43,且CX43以點(diǎn)狀的模式隨意分布于細(xì)胞的接觸界面上,與心肌細(xì)胞的CX43分布(局限在閏盤

19、)顯著不同。移植區(qū)域未見IgG的表達(dá)及CD3+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)建立了一種能夠滿足膜片鉗檢測(cè)需要的心肌組織切片方法,并在此基礎(chǔ)上成功對(duì)移植到宿主心肌組織中的起搏細(xì)胞進(jìn)行了原位的電生理學(xué)研究。
　　2.mHCN4基因修飾的大鼠MSCs(HCN4-MSCs)同種移植到宿主心臟中能存活4周以上,并持續(xù)表達(dá)超極化激活的起搏電流(If)。體內(nèi)對(duì)照組的MSCs(MSCs-EGFP)不表達(dá)If。
　　3

20、.移植的HCN4-MSCs表達(dá)的If電流幅值與體外對(duì)照組相似,但膜電容及電流密度與體外對(duì)照組細(xì)胞有顯著差異。與體外對(duì)照組的細(xì)胞相比,移植的HCN4-MSCs的If電流激活閾電位及半激活電壓顯著負(fù)移(差異達(dá)顯著性),激活曲線斜率增大(差異達(dá)顯著性),激活時(shí)間常數(shù)延長(zhǎng)(但差異未達(dá)顯著性),翻轉(zhuǎn)電位無顯著差異。
　　4.移植后4周,HCN4-MSCs及MSCs-EGFP均不表達(dá)去極化激活的內(nèi)向鈉電流及鈣電流,未記錄到動(dòng)作電位。MSCs與