輸注TGF-β1基因修飾的供體脾細(xì)胞誘導(dǎo)同種大鼠移植心臟耐受的試驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分大鼠頸部異位心臟移植模型的建立 目的：建立一種簡單實(shí)用的同種大鼠心臟移植模型，以利于研究移植免疫的機(jī)制。 方法：SD鼠供心之無名動(dòng)脈及肺動(dòng)脈分別與Wistar受鼠右頸總動(dòng)脈及頸外靜脈端端吻合。 結(jié)果：正式心臟移植100例，手術(shù)成功率為83％。手術(shù)時(shí)間為70±15分鐘，平均冷缺血時(shí)間為45±15。手術(shù)主要并發(fā)癥是麻醉意外、動(dòng)脈吻合口出血和血栓形成、靜脈吻合口狹窄、失血性休克。未作任何處理的移植心臟平均存活時(shí)

2、間為7.0±3.7天，停跳移植心臟病理表現(xiàn)為急性排斥反應(yīng)改變。 結(jié)論：同種大鼠頸部異位心臟移植模型是研究免疫移植機(jī)制的良好模型。 第二部分TGF-β1真核表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染表達(dá)效率的研究 目的：構(gòu)建攜帶TGF-β1基因的真核表達(dá)載體，了解其在真核細(xì)胞的表達(dá)效果。 方法：提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定。并用脂質(zhì)體包裹TGF-β1基因轉(zhuǎn)染脾細(xì)胞，采用標(biāo)記基因和免疫印跡的方法檢測脾細(xì)胞分泌的TGF-β1蛋

3、白水平。 結(jié)果：成功構(gòu)建了TGF-β1真核表達(dá)載體，并獲得穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1蛋白的脾細(xì)胞。 結(jié)論：脂質(zhì)體包裹TGF-β1基因轉(zhuǎn)染的方法可獲得穩(wěn)定和高效目的基因的表達(dá)，可用于下一步基因治療的研究。 第三部分TGF-β1基因修飾的供體脾細(xì)胞抑制了同種反應(yīng)性T細(xì)胞的功能 目的：研究TGF-β1基因修飾的供體脾細(xì)胞對(duì)同種T細(xì)胞體外活化和增殖的影響及作用機(jī)制。 方法：制備穩(wěn)定表達(dá)的SD供鼠脾細(xì)

4、胞，進(jìn)行大鼠淋巴細(xì)胞增殖和單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)，并以流式細(xì)胞儀分析TGF-β1蛋白對(duì)同種T細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響。 結(jié)果：pEGFP-TGF-β1基因轉(zhuǎn)染對(duì)淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用；TGF-β1基因修飾的脾細(xì)胞引起同種淋巴細(xì)胞低反應(yīng)，在刺激細(xì)胞/效應(yīng)細(xì)胞比值為1：1、1：10和1：50時(shí)，其抑制效率分別為34.86％、43.38％和20.50％；TGF-β1基因修飾的供體脾細(xì)胞通過分泌TGF-β1蛋白，阻止同種T細(xì)胞從

5、G0/G1期進(jìn)入S期以及從S期進(jìn)入G2/M期，抑制淋巴細(xì)胞的增殖。 結(jié)論：TGF-β1基因修飾的供體脾細(xì)胞通過分泌TGF-β1蛋白，干擾同種T細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制T細(xì)胞活化和增殖，發(fā)揮其免疫抑制作用。 第四部分輸注TGF-β1基因修飾的供體脾細(xì)胞對(duì)同種大鼠移植心臟存活時(shí)間的影響 目的：供者特異性輸注可誘導(dǎo)同種移植物耐受，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)可抑制淋巴細(xì)胞的增殖和功能；我們研究TGF-β1

6、基因修飾的供者脾細(xì)胞特異性輸注，對(duì)同種移植物耐受的誘導(dǎo)和對(duì)同種大鼠異位移植心存活時(shí)間的影響。 方法：建立同種大鼠異位心臟移植模型；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分三組：(1)假處理組：移植7天前，受鼠經(jīng)尾靜脈輸注不完全RPMI-1640培養(yǎng)液2ml。(2)單純脾細(xì)胞輸注組：移植7天前，受鼠經(jīng)尾靜脈輸注5×106個(gè)SD鼠脾細(xì)胞。(3)TGF-β1基因修飾的脾細(xì)胞特異性輸注組：移植7天前，受鼠經(jīng)尾靜脈輸注5×106個(gè)TGF-β1基因修飾的SD鼠脾細(xì)胞。觀