SIRT3基因干擾后對(duì)ox-LDL刺激的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、E-selectin表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　炎癥在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病過程中起重要作用。動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)過程均有炎癥介質(zhì)如各種粘附分子等參與炎癥反應(yīng)。減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷的炎癥反應(yīng)是緩解動(dòng)脈粥樣硬化的重要途徑。目前，研究顯示人類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙?；?(SIRT3)在能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌細(xì)胞肥大、長壽等機(jī)制方面發(fā)揮重要作用，但其在動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞損傷反應(yīng)過程中的作用國內(nèi)外少見報(bào)道。因此，本研究旨在探討人SIRT3與內(nèi)

2、皮細(xì)胞損傷過程中炎性因子的調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步揭示SIRT3在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中的作用。
　　研究方法：
　　1.干擾序列的篩選
　　(1)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng):人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基+1％內(nèi)皮生長因子+5％胎牛血清的培養(yǎng)液在37℃、5％CO2條件下貼壁培養(yǎng)，選擇3-7代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　(2)分組與轉(zhuǎn)染:將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、SIRT3

3、siRNA(1、2、3、4)組。待細(xì)胞70％-80％融合時(shí)用轉(zhuǎn)染試劑hiperfect進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組只加轉(zhuǎn)染試劑不加干擾序列。陰性對(duì)照組添加陰性對(duì)照序列和轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染24h后檢測相關(guān)指標(biāo)。
　　(3)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　(4)熒光倒置顯微鏡觀察陰性對(duì)照組熒光蛋白表達(dá)。
　　(5)qRT-PCR檢測各組SIRT3 mRNA表達(dá)。
　　(6)Western blot檢測各組SIRT3蛋白質(zhì)的表達(dá)

4、。
　　2、SIRT3干擾后檢測ox-LDL刺激的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞SIRT3 mRNA，ICAM-1、E-selectin蛋白的表達(dá)。
　　(1)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為空白對(duì)照組、siRNA組、(20、30、40μg/mL)ox-LDL組、siRNA+(20、30、40μg/mL)ox-LDL組。ox-LDL各組分別按濃度加入ox-LDL刺激6h;siRNA為篩選出的最佳SIRT3干擾序列，siRNA+ox-LDL組為轉(zhuǎn)染24h后加入

5、ox-LDL刺激6h。
　　(2)qRT-PCR檢測各組SIRT3 mRNA的表達(dá)。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測ICAM-1、E-selectin抗體的平均熒光強(qiáng)度值。
　　結(jié)果：
　　1.干擾序列篩選結(jié)果
　　(1)光學(xué)顯微鏡下，與空白對(duì)照組相比，SIRT3 siRNA各組的細(xì)胞多數(shù)體積增大，細(xì)胞均質(zhì)性降低，細(xì)胞間隙增大。這些特征在SIRT3 siRNA2組較明顯。
　　(2)與光學(xué)顯微鏡下同一視野對(duì)

6、比，陰性對(duì)照90％以上細(xì)胞顯示綠色熒光。
　　(3)與各對(duì)照組相比，4條SIRT3 siRNA序列均在不同程度上下調(diào)了SIRT3mRNA的表達(dá)（P均＜0.05）。其中:SIRT3 siRNA2組干擾效果最好，沉默效率為88.616％。
　　(4)4個(gè)SIRT3 siRNA組分別與各對(duì)照組相對(duì)灰度值相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。其中:SIRT3 siRNA2組干擾效果最為顯著，沉默效率為:80.372％。

7、　　2.SIRT3干擾后不同濃度ox-LDL刺激，SIRT3 mRNA，ICAM-1、E-selectin蛋白表達(dá)
　　(1)與空白對(duì)照組相比，ox-LDL各濃度組的SIRT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）;且隨ox-LDL濃度增加，mRNA表達(dá)逐漸降低(P均＜0.05)。與空白對(duì)照組相比，siRNA組的SIRT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＜0.001)。siRNA+ox-LDL各組的SIRT3 m

8、RNA相對(duì)表達(dá)量與siRNA組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。
　　(2)與空白對(duì)照組相比，siRNA組及ox-LDL各濃度組的ICAM-1MFI均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。與siRNA組相比，siRNA+ox-LDL各組的ICAM-1MFI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）;隨著ox-LDL濃度增加，siRNA+ox-LDL各組的ICAM-1MFI依次明顯增加（P均＜0.05）。
　　(3)與空白對(duì)照組相比，s

9、iRNA組及20、30μg/mL ox-LDL組的E-selectin MFI無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），40μg/mL ox-LDL組的E-selectin MFI顯著增加(P＜0.05)。與siRNA組相比，siRNA+ox-LDL各組的E-selectin MFI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）;且隨著ox-LDL濃度的增加，siRNA+ox-LDL各組的E-selectin MFI依次明顯增加（P均＜0.05）。
　

10、　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究成功篩選了SIRT3基因小干擾RNA序列。準(zhǔn)確沉默SIRT3基因，為研究人SIRT3與其他基因的調(diào)控關(guān)系提供便利。
　　2、通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，較低濃度ox-LDL刺激時(shí)，人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞SIRT3基因表達(dá)顯著增高;隨ox-LDL濃度進(jìn)一步增加，SIRT3表達(dá)反而降低。提示SIRT3作為保護(hù)因子存在代償作用，但其代償作用受到ox-LDL濃度的限制。
　　3、SIRT3基因與ox-LDL