MUC4在肺腺癌轉(zhuǎn)移及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變中的功能研究.pdf

1、目的：
　　肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，腺癌是肺癌中最常見的一種類型。MUC4粘附蛋白是一種高分子量跨膜糖蛋白，與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，并且MUC4的過量異常表達(dá)常在癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中被觀察到。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為具有運(yùn)動(dòng)能力的間充質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，它存在于動(dòng)物多個(gè)生理和病理過程中，并涉及復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)節(jié)過程，行使多種生理功能。這個(gè)過程最初發(fā)現(xiàn)于早期胚胎發(fā)育進(jìn)展中，并且與組織的纖維化也相

2、關(guān)聯(lián)，之后，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變也與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究旨在觀察MUC4在肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的功能作用，同時(shí)進(jìn)一步研究其對(duì)上皮間質(zhì)化的調(diào)控機(jī)制，為肺腺癌臨床診斷及治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞株，通過Western Blotting試驗(yàn)，檢測(cè)MUC4粘蛋白在肺腺癌細(xì)胞株中的高低表達(dá)。構(gòu)建MUC4-siRNA表達(dá)載體，經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞株，分為實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染載體MUC4-siRNA）及對(duì)照組

3、(空載體Control-siRNA)，Western Blotting試驗(yàn)檢測(cè)MUC4、E-cadherin、Vimentin的表達(dá)變化，倒置顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)的變化，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察MUC4高低表達(dá)對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MUC4高低表達(dá)對(duì)β-catenin的影響，并且通過Western Blotting試驗(yàn)檢測(cè)β-catenin在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的表達(dá)變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為MUC4-knockdown-LTE

4、P種植鼠(129/sv)及MUC4-control-LTEP種植鼠(129/sv)兩組，免疫組化及Western Blotting試驗(yàn)檢測(cè)兩組鼠肺組織中的MUC4、E-cadherin、Vimentin的變化。通過PET-CT從天津市腫瘤醫(yī)院篩選出各15例Ⅰ期及Ⅲ期病人，并取其肺癌組織標(biāo)本，病理證實(shí)Ⅰ期及Ⅲ期肺腺癌標(biāo)本各10例，Western Blotting試驗(yàn)檢測(cè)20例肺癌組織標(biāo)本中MUC4粘蛋白的表達(dá)變化，通過統(tǒng)計(jì)分析20例肺癌組

5、織標(biāo)本中MUC4粘蛋白高低表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，MUC4粘蛋白在肺腺癌細(xì)胞株LTEP、SPCA中高表達(dá)，然而在肺腺癌細(xì)胞株GLC-82、A549中低表達(dá)。MUC4-siRNA經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染LTEP細(xì)胞，LTEP細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，與對(duì)照組相比較，MUC4粘蛋白和上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)增加;LTEP細(xì)胞(轉(zhuǎn)染MUC4-siRNA)

6、形態(tài)分別從卵圓形轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形，細(xì)胞極及細(xì)胞接觸排列無(wú)序。2.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比，LTEP細(xì)胞(轉(zhuǎn)染MUC4-siRNA)穿孔細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.01)。
　　3.細(xì)胞免疫熒光及Western Blotting定量實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組LTEP細(xì)胞中β-catenin向細(xì)胞質(zhì)集聚及細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，與細(xì)胞膜結(jié)合的β-catenin明顯減少。
　　4.原位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?與MUC4-control-LTEP種植鼠相比，

7、MUC4-knockdown-LTEP種植鼠，腫瘤肺組織中MUC4粘蛋白和上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)明顯減少，間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)明顯增加。
　　5.人肺腺癌標(biāo)本W(wǎng)estern Blotting定量實(shí)驗(yàn):10例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌標(biāo)本中6例MUC4低表達(dá)，然而，10例伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌標(biāo)本中MUC4全部低表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析20例肺腺癌標(biāo)本中MUC4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性，數(shù)據(jù)顯示MUC4低表達(dá)與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相

8、關(guān)（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.MUC4粘蛋白低表達(dá)可誘導(dǎo)LTEP細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　2.隨著MUC4粘蛋白低表達(dá)，LTEP細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.01)，表明MUC4粘蛋白與肺腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力有關(guān)。
　　3.隨著MUC4粘蛋白低表達(dá)，LTEP細(xì)胞中β-catenin分別向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移及細(xì)胞質(zhì)集聚，與細(xì)胞膜結(jié)合的β-catenin明顯減少，表明MUC4粘蛋白通過調(diào)控β-catenin胞

9、核轉(zhuǎn)位抑制肺腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。
　　4.通過原位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，MUC4-knockdown-LTEP種植鼠肺組織中MUC4粘蛋白的減少伴隨著上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)增加，表明在體內(nèi)試驗(yàn)中MUC4粘蛋白表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生相關(guān)。
　　5.在沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的10例Ⅰ期肺腺癌標(biāo)本中6例MUC4低表達(dá)，然而，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的10例Ⅲ期肺腺癌標(biāo)本中MUC4全部低表達(dá)，并且通過