新型兩親性低分子量硫酸軟骨素的制備及其抑制ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的研究.pdf

1、研究目的：
　　硫酸軟骨素(chondroitinsulfate，CS)是一類(lèi)硫酸化的糖胺聚糖，存在于細(xì)胞表面和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)中，主要分布于軟骨、骨、肌腱、神經(jīng)組織和血管壁中。CS的基本結(jié)構(gòu)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1，3糖苷鍵連接形成的二糖，二糖之間以β-1，4糖苷鍵連接而成。CS具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、心腦血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)等多種藥理生理學(xué)活性與功能，且長(zhǎng)期服用毒副作用小或無(wú)毒副作用。

2、在歐洲、美國(guó)、東南亞、澳大利亞等國(guó)家，CS主要作為膳食補(bǔ)充劑或藥品，用于心腦血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的預(yù)防與治療。但是，由于其分子量大、親水基團(tuán)多、脂溶性差，體內(nèi)吸收不完全，口服生物利用度低;在CS治療心腦血管疾病的研究中，其降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的療效和量效關(guān)系以及其抑制斑塊性的分子機(jī)制都尚不明確。為了解決這些問(wèn)題，本研究擬對(duì)CS結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾改造，采用降低分子量、增加親脂基團(tuán)、構(gòu)建兩親性納米粒子等方法來(lái)改善其口服吸收效果，然后通

3、過(guò)整體動(dòng)物法篩選出腸道吸收效果好的CS衍生物，并采用Caco-2細(xì)胞模型對(duì)其促腸道吸收作用機(jī)制進(jìn)行探討;構(gòu)建ApoE-/-小鼠AS動(dòng)物模型，考察CS及其衍生物對(duì)AS斑塊的抑制作用，并對(duì)其可能的抗AS作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　研究方法：
　　1.具有兩親性的α-亞麻酸-低分子量硫酸軟骨素結(jié)合物的制備及表征
　　采用H2O2氧化降解法對(duì)CS進(jìn)行降解，制備低分子量CS(LMCS)，并采用親脂性的α-亞麻酸(α-LNA)對(duì)LMC

4、S進(jìn)行修飾，合成出一系列α-LNA取代度不同的兩親性L(fǎng)MCS(α-LNA-LMCS)。采用紅外光譜法(FTIR)、核磁共振波譜法(NMR)以及熱差-熱重分析法(TGA/DSC)對(duì)兩親性α-LNA-LMCS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;對(duì)兩親性α-LNA-LMCS的自組裝及其自組裝后的膠束的粒徑大小、粒徑分布、Zeta電位、表面形態(tài)、臨界膠束濃度以及生物安全性等性能進(jìn)行研究。
　　2.CS及其衍生物的體內(nèi)外腸道吸收及其機(jī)制研究
　　采用整體

5、動(dòng)物模型考察CS及其衍生物的腸道吸收效果，篩選出腸道吸收效果好的α-LNA-LMCS;采用Caco-2細(xì)胞模型驗(yàn)證整體模型的研究結(jié)果，通過(guò)跨膜電阻的變化考察藥物種類(lèi)、濃度以及作用時(shí)間對(duì)Caco-2單層細(xì)胞完整性的影響;激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察CS及其衍生物在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)及其對(duì)Caco-2細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)表達(dá)的影響，研究α-LNA-LMCS促進(jìn)LMCS腸道吸收的作用機(jī)制。
　　3.CS衍生物的抗動(dòng)脈粥

6、樣硬化活性及其機(jī)制研究
　　8周齡ApoE-/-小鼠104只隨機(jī)分成8組（每組13只），高脂高膽固醇飲食(15％脂肪和0.25％膽固醇)，同時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)，16周后用10％水合氯醛麻醉，心臟取血，制備血漿后生化法測(cè)定小鼠血漿中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量，考察藥物對(duì)小鼠血脂的影響。ELISA法測(cè)定小鼠血漿中IL-6、TNF-α、C-反應(yīng)蛋白(CRP)的

7、含量。通過(guò)對(duì)小鼠主動(dòng)脈表面AS病變分析及主動(dòng)脈根部病灶的蘇木素-伊紅(H&E)染色、油紅O染色、Masson染色、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞免疫組化染色考察CS及其衍生物對(duì)AS斑塊形成的影響;WesternBlot法考察小鼠主動(dòng)脈中p-NF-κB、p-JNK、p-ERK1/2、COX-2、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1等蛋白的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量PCR法考察小鼠主動(dòng)脈中IL-6、TNF-α、CRP、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1

8、等炎癥相關(guān)因子基因的表達(dá)。從炎癥調(diào)節(jié)方面探討CS及其衍生物抗AS的分子機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　　1.具有兩親性的α-亞麻酸-低分子量硫酸軟骨素結(jié)合物的制備及表征
　　合成了一系列α-LNA取代度不同的兩親性α-LNA-LMCS，并對(duì)其進(jìn)行了表征。FT-IR、1HNMR以及TGA/DSC分析結(jié)果表明，α-LNA作為側(cè)鏈通過(guò)與D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖糖環(huán)上的羥基形成酯鍵而連接到LMCS的主鏈上，α-LNA取

9、代度在0.034-0.123的范圍內(nèi);激光光散射儀、電位分析儀以及掃描電鏡表征結(jié)果表明，α-LNA-LMCS膠束外觀(guān)呈球形結(jié)構(gòu)，水合粒徑在78-117nm的范圍內(nèi)，Zeta電位在-30～-25mV之間，粒徑大小適宜且粒徑分布范圍較窄;熒光光譜法考察α-LNA-LMCS自聚集性能的結(jié)果表明，α-LNA-LMCS能夠在水溶液中形成較穩(wěn)定的膠束，且α-LNA-LMCS膠束的臨界膠束濃度在0.016-0.20mg/mL之間。
　　2.CS

10、及其衍生物的體內(nèi)外腸道吸收及其機(jī)制
　　CS及其衍生物的動(dòng)物體內(nèi)腸道吸收研究發(fā)現(xiàn)，LNA-LMCS2在血漿中的最高濃度Cmax、達(dá)峰時(shí)間Tmax、半衰期t1/2、體內(nèi)總清除率CL以及曲線(xiàn)下面積AUC0-24分別為10.8±0.5mg/L、8.8±2.3h、18.8±3.1h、0.6±0.4L/(h·kg)以及12.0±0.6h，Cmax分別是CS和LMCS的2.8倍和1.6倍，t1/2是CS和LMCS的1.7倍和3.2倍，CL分別

11、是CS和LMCS的0.18倍和0.19倍，AUC0-24分別是CS和LMCS的4.13倍和3.12倍，這些表明LMCS在經(jīng)α-LNA修飾后腸道吸收效果得到顯著的改善。
　　Caco-2細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，與CS及LMCS相比，LNA-LMCS2表觀(guān)滲透系數(shù)Papp大(p＜0.001)、外排率低(p＜0.05)，LNA-LMCS2可以抑制P-gp的活性，減少藥物的外排，通過(guò)胞吞作用來(lái)促進(jìn)增加LMCS的腸道吸收。對(duì)Caco-2單層細(xì)胞膜

12、的跨膜電阻研究發(fā)現(xiàn)，LNA-LMCS2作用后，Caco-2單層細(xì)胞膜的跨膜電阻明顯降低，通透性增加，這表明LNA-LMCS2可能打開(kāi)了Caco-2單層細(xì)胞膜間的緊密連接。激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，LNA-LMCS2可以影響F-肌動(dòng)蛋白的微絲及骨架，打開(kāi)細(xì)胞間緊密連接，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，且對(duì)單層細(xì)胞膜整體完整性沒(méi)有影響。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，經(jīng)α-LNA修飾后的LMCS可以通過(guò)促進(jìn)胞吞作用和增加旁路吸收兩種方式來(lái)提高LMCS的腸道吸收。<

13、br>　　3.CS衍生物的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性及其機(jī)制
　　藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，8組間的小鼠體重未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，這說(shuō)明給藥各組對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重沒(méi)有顯著性的影響;與對(duì)照組相比，H-LNA-LMCS2組及H-LMCS組ApoE-/-小鼠血液中LDL-C和TG的濃度明顯降低(p＜0.05);H-LNA-LMCS2組ApoE-/-小鼠血液中TNF-α、IL-6和CRP的濃度顯著降低。這些結(jié)果表明，LNA-LMCS2可以有效地降低

14、AS模型中ApoE-/-小鼠的血脂濃度，并能夠抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。
　　小鼠主動(dòng)脈脈面病變分析（大體油紅O染色）研究表明，與對(duì)照組相比，H-LNA-LMCS2組及H-LMCS組的病變面積明顯降低，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01和p＜0.05);小鼠主動(dòng)脈竇冰凍切片H&E染色和油紅O染色研究表明，H-LNA-LMCS2組和H-LMCS組斑塊面積/主動(dòng)脈竇瓣環(huán)面積比值明顯減少(p＜0.001和p＜0.05);小鼠主動(dòng)脈竇冰凍切片M

15、asson染色表明，LNA-LMCS2及LMCS對(duì)給藥各組斑塊中膠原纖維含量影響不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;小鼠主動(dòng)脈竇冰凍切片免疫組化研究表明，與對(duì)照組相比，H-LNA-LMCS2組和H-LMCS組小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞的含量明顯降低(p＜0.05)，平滑肌細(xì)胞明顯升高(p＜0.05);高劑量的LNA-LMCS2及LMCS可以有效的抑制AS模型中ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊的形成。
　　Westernblot及RT-PCR研究結(jié)果表明，LN

16、A-LMCS2和LMCS能夠通過(guò)下調(diào)磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p--ERK1/2)抑制p-NF-κB的核轉(zhuǎn)位，下調(diào)COX-2、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)，降低IL-6、TNF-α、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1的mRNA水平。
　　以上結(jié)果表明，LNA-LMCS2和LMCS的延緩AS斑塊發(fā)展的作用可能是通過(guò)降脂和抗炎兩條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論和意義：
　　1.本研究成功的采用α-LNA通過(guò)酯

17、化反應(yīng)對(duì)LMCS進(jìn)行了修飾，制備出了口服生物利用度良好的兩親性CS衍生物。
　　2.兩親性L(fǎng)NA-LMCS2促進(jìn)LMCS腸道吸收的作用機(jī)制研究表明，LNA-LMCS2可以通過(guò)促進(jìn)胞吞作用和增加旁路吸收兩種方式來(lái)提高LMCS的腸道吸收。
　　3.高劑量(400mg/kg)的LNA-LMCS2和LMCS對(duì)ApoE-/-小鼠具有較好的降脂和抑制促炎酶及促炎因子的作用，可以通過(guò)降脂和抗炎兩種途徑來(lái)抑制ApoE-/-小鼠AS斑塊形成及