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文檔簡介
1、近年來,由動脈粥樣硬化引起的心、腦血管事件發(fā)生率越來越高。這些病例中相當一部分的病理基礎(chǔ)是斑塊內(nèi)出血。斑塊內(nèi)出血與斑塊內(nèi)微血管新生有密不可分的聯(lián)系。
類胰蛋白酶(tryptase)是一種具有多種生物學(xué)活性的天然蛋白酶,與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我室前期研究證明:類胰蛋白酶能夠招募中性粒細胞,啟動炎癥反應(yīng);能夠刺激內(nèi)皮細胞合成IL-1β和IL-8,并促進IL-8的釋放;通過激活單核細胞膜上的PAR-2,大量分泌IL-6、
2、TNF-α和IL-1β,從而影響動脈粥樣硬化的血管炎性病變過程。而最近研究表明,在真皮組織中,抑制類胰蛋白酶活性可顯著降低肥大細胞刺激內(nèi)皮細胞使其形成毛細血管管腔樣結(jié)構(gòu)的能力,并明確提出,類胰蛋白酶是一種新發(fā)現(xiàn)的、強有力的血管新生誘導(dǎo)因子。但類胰蛋白酶是否促進動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)出血目前還不清楚。本課題擬構(gòu)建過或干擾表達類胰蛋白酶的慢病毒載體,從體內(nèi)和體外兩方面探討類胰蛋白酶與斑塊內(nèi)出血的關(guān)系。
本研究主要分三部分,
3、第一部分構(gòu)建類胰蛋白酶表達或干擾慢病毒載體
我們采用全基因酶切位點設(shè)計、合成獲得小鼠類胰蛋白酶基因,在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了過表達和干擾tryptase慢病毒載體,為下一步進行體內(nèi)體實驗奠定基石出。
第二部分類胰蛋白酶對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)出血的影響及機制
我們首先對ApoE-/-小鼠行頸總動脈套環(huán)術(shù),建立動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)出血模型。然后,對小鼠尾靜脈注射過或干擾表達類胰蛋白酶的慢病毒載體,觀察
4、斑塊狀況。實驗分為肥大細胞脫顆粒組、肥大細胞穩(wěn)定劑組、LV-GFP-Tryptase脫顆粒組、LV-GFP脫顆粒組、LV-RFP-siRNA穩(wěn)定劑組和LV-RFP-controlsiRNA穩(wěn)定劑組。HE染色結(jié)果顯示,未套環(huán)側(cè)LV-GFP-Tryptase脫顆粒組頸總動脈斑塊面積顯著大于其他組,而LV-RFP-siRNA穩(wěn)定劑組斑塊面積最小。肥大細胞脫顆粒組斑塊面積小于LV-GFP-Tryptase脫顆粒組,但大于肥大細胞穩(wěn)定劑組,提示肥
5、大細胞脫顆粒劑compound48/80具有類胰蛋白酶相似的作用,但是效果較弱。套環(huán)側(cè)除LV-RFP-siRNA穩(wěn)定劑組外,其余各組動脈均狹窄均達90%以上,過表達類胰蛋白酶明顯促進套環(huán)側(cè)斑塊內(nèi)出血,出血率及程度遠大于干擾組,compound48/80亦具有促進斑塊內(nèi)出血作用,但效果弱于過表達類胰蛋白酶。免疫組化染色結(jié)果顯示,套環(huán)側(cè)LV-GFP-Tryptase脫顆粒組CD31表達最高,凝血纖溶因子PAI降低,tPA升高;而LV-RFP
6、-siRNA穩(wěn)定劑組CD31表達最低,凝血纖溶因子PAI升高,tPA降低。
第三部分類胰蛋白酶對小鼠微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3細胞增殖、遷移、管腔形成的影響
將LV-GFP-Tryptase慢病毒及對照病毒轉(zhuǎn)入小鼠肥大細胞P815細胞,并設(shè)空白對照。收集3組上清,作為條件培養(yǎng)液分別培養(yǎng)bEnd.3細胞后,檢測bEnd.3細胞增殖、遷移和管腔形成能力及PAI和tPA表達。結(jié)果顯示LV-GFP-Tryptase慢病毒組條
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