IGF1通過PPARγ-Axin2-Wnt信號通路促進內源性脂肪干-前體細胞成脂分化.pdf

1、目的：外傷、腫瘤切除、先天性畸形等常造成機體軟組織的缺損，如何有效地修復軟組織缺損是目前組織工程領域的重點和難點。隨著干細胞技術的深入研究與發(fā)展，將干細胞作為種子細胞應用于修復軟組織缺損是目前最有前景的方法。脂肪間充質干細胞（adipose stem cells，ASCs）由于具有來源豐富、取材方便、培養(yǎng)簡單、具有多分化潛能且無倫理學障礙等優(yōu)點，成為目前組織工程領域最受關注的種子細胞。但從脂肪組織中通過膠原酶消化、過濾、離心等步驟獲得的

2、脂肪組織來源血管基質成分（Stromal Vascular Fraction，SVF），并不是單純的ASCs，而是一群混合細胞群體，經過2-3次的消化傳代能得到一定的純化，目前用于基礎及臨床研究的大部分都是這種非完全純化的細胞。近年來，關于ASCs在脂肪組織中的原位起源（In Situ location）及SVF中亞細胞群的多向分化的報道增加。然而由于間充質干細胞沒有特異的表面標志，到目前為止，關于ASCs在脂肪組織中的原位定位尚未確切

3、定論。研究這一問題對于更好地將ASCs用于軟組織修復至關重要。
　　大量研究表明，脂肪細胞分化是一個受多種轉錄因子、生長因子及信號通路調控的非常精細且復雜的過程。其中轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）在這一過程中起著關鍵的開啟作用，它對體內脂肪組織的形成是必須的，敲除3T3-L1細胞中的PPARγ基因會導致其喪失成脂分化能力，而且缺乏PPARγ基因的小鼠胚胎也不能形成脂肪組織。Wnt信號通路是對細胞增殖以及間充質

4、干細胞的成骨、成脂分化平衡起調控作用的重要通路，PPARγ能否通過調控Wnt信號通路來促進脂肪細胞分化以及如何調控Wnt信號通路，目前尚不清楚。另外，胰島素/胰島素生長因子-1（Insulin-like growth factor-1，IGF1）也是成脂分化過程必不可少的，雖然有文獻報道IGF1與靶細胞膜上的特異性受體結合以后，能促進靶細胞的增殖和成脂分化，但對于IGF1在促進成脂分化過程中是否能影響 Wnt信號通路及周圍靶細胞，尚無相

5、關報道。對這些問題的探討有助于更有效地將IGF1應用于脂肪組織再生。
　　本研究流式分選出SVF中的亞細胞群CD31-/CD34+/CD146+及CD31-/CD34+/CD146-，擬通過比較這兩亞細胞群的體外增殖、成脂成骨分化能力及潛在的機制研究，尋找到具有更強成脂能力的種子細胞。同時，通過IGF1促進成脂的機制及應用研究，找到更有效的脂肪組織再生新方法。研究分為三個部分：不同細胞亞群體外增殖、多向分化能力的比較；PPARγ-

6、Axin2-Wnt信號通路在成脂分化過程中的機制研究；IGF1對Wnt信號通路和SVF中亞細胞群的影響，以及在促進脂肪再生中的應用研究。
　　方法：(1)將新鮮的人脂肪組織做冰凍切片，免疫熒光檢測 CD31、CD34、CD146在脂肪組織中的分布情況。分離培養(yǎng)脂肪組織來源的SVF，通過流式細胞儀分選，將細胞分為CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-亞群，重點分析兩亞群在SVF中所占的比例，比較兩

7、者的增殖、成脂成骨分化能力，檢測分化相關基因的表達。
　　(2)比較對細胞的增殖及成脂成骨分化能力有重要調控作用的Wnt/β-catenin信號通路在細胞亞群中的強弱。檢測亞群細胞中PPARγ與Wnt對彼此的調控，并進一步檢測PPARγ與Wnt信號通路抑制劑Axin2的關系。過表達或干擾PPARγ表達后，檢測Axin2的基因表達。Axin2的啟動子上有PPARγ的結合位點，通過免疫熒光素酶報告系統(tǒng)分析此結合位點存在及切除后，轉染P

8、PARγ對Axin2表達的影響。并檢測干擾Axin2對ASCs成脂分化的影響。
　　(3)體外檢測IGF1對ASCs增殖、遷移及成脂分化的影響，分析用IGF1處理后的ASCs中CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-比例的變化，并檢測IGF1對CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-亞群細胞的增殖、成脂分化及Wnt活性的影響。用微球作為IGF1的緩釋載體，將含有微

9、球的PLGA支架材料移植入C57B16小鼠腹股溝的脂肪墊處，4周后檢測支架中脂肪組織生長情況。
　　結果：(1)免疫熒光結果顯示，CD34+的細胞主要分布在脂肪組織的血管周圍；CD146+的細胞在血管壁上以及廣泛地分布于脂肪周圍結締組織中，在血管周圍存在CD34與CD146的共定位；CD31+的細胞主要分布在血管腔內，有少量與CD146共定位，故在脂肪組織的血管周圍確實存在兩群細胞CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/

10、CD34+/CD146-。流式結果顯示第一代的SVF中 CD31-/CD34+/CD146+的比例明顯高于CD31-/CD34+/CD146-，兩亞群在SVF中的比例都會隨著細胞傳代而降低，但在CD31-/CD34+的細胞中，CD146-的比例下降，CD146+的比例升高。
　　(2)兩細胞亞群相比較，CD31-/CD34+/CD146+細胞的增殖能力強于CD31-/CD34+/CD146-，但CD31-/CD34+/CD146-

11、具有很強大的成脂分化能力，而成骨分化能力較弱。成脂分化轉錄因子 PPARγ、脂肪酸結合蛋白4（FABP4）及成骨分化相關基因Runx2、OCN、CollagenⅠ的表達也證實了這一現(xiàn)象。對細胞增殖和多向分化有重要調控作用的Wnt/β-catenin信號通路在CD31-/CD34+/CD146+細胞中有更強的活性。
　　(3)成脂分化過程中，轉錄因子PPARγ與Wnt信號通路之間有負反饋調節(jié)作用，而與Wnt信號通路的抑制劑Axin2

12、存在高度的線性相關。染色質免疫共沉淀等檢測發(fā)現(xiàn)PPARγ能直接調控Axin2的表達。這些結果表明PPARγ通過促進Axin2的表達來下調Wnt信號通路，從而促進ASCs的成脂分化。
　　(4)IGF1能誘導CD31-/CD34+/CD146+向CD31-/CD34+/CD146-細胞轉化，且能促進兩細胞亞群及SVF的增殖、遷移、成脂分化。通過PLGA支架材料將IGF1移植到小鼠體內，發(fā)現(xiàn)IGF1能誘導宿主脂肪組織中的ASCs的歸巢

13、，促進局部的脂肪組織再生。
　　結論：尋找最佳的種子細胞是干細胞在組織工程領域應用需要解決的關鍵問題之一。SVF中的CD31-/CD34+/CD146-具有更強的成脂分化能力，PPARγ-Axin2-Wnt信號通路在其中起著非常關鍵的作用，PPARγ能通過促進Axin2的表達來下調Wnt信號通路，從而促進ASCs的體外成脂分化；而IGF1能誘導CD31-/CD34+/CD146+向CD31-/CD34+/CD146-細胞轉化，且能