Musashi-2通過Wnt-β-catenin信號通路促進(jìn)乙肝病毒相關(guān)性肝癌進(jìn)展的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　擬對MSI2基因在肝癌中與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系作進(jìn)一步的深入研究，以期為闡明肝癌的發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù)并為下一步可能的基因治療提供新的分子靶點。本文擬從以下三個方面進(jìn)行研究:一:MSI2在HCC中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義研究;二:MSI2在體外實驗中對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究;三:MSI2在體內(nèi)實驗中對肝癌進(jìn)展的影響及調(diào)控機(jī)制研究。
　　研究方法：
　　一.MSI2在

2、HCC中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義研究
　　1.應(yīng)用RealtimePCR法在分子水平檢測10例肝癌患者M(jìn)SI2及β-catenin基因的表達(dá)，并進(jìn)一步分析MSI2及β-catenin的表達(dá)趨勢相關(guān)性。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測106例乙肝病毒相關(guān)性肝癌及癌旁硬化肝組織芯片中MSI2及β-catenin基因的表達(dá)，分析MSI2的表達(dá)變化與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性;分析MSI2與β-catenin的表達(dá)趨勢相關(guān)性;建立CO

3、X風(fēng)險比例回歸模型，對肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的多種危險因素行回歸分析，并對肝癌患者總體生存及無瘤生存應(yīng)用Kplan-meier法行生存分析，探討MSI2的表達(dá)變化與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。
　　二.MSI2在體外實驗中對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究
　　1.應(yīng)用Realtime PCR法檢測三種肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B中MSI2基因的表達(dá)，篩選高表達(dá)MSI2基因的細(xì)胞系。
　　2.構(gòu)建針對MS

4、I2基因的shRNA干擾表達(dá)載體，MTT法檢測不同shRNA干擾載體作用后的肝癌細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞活力，篩選MSI2基因沉默最優(yōu)的shRNA干擾表達(dá)載體。
　　3.將攜帶RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)MSI2基因的肝癌細(xì)胞系;應(yīng)用軟瓊脂克隆形成實驗檢測不用組別肝癌細(xì)胞的克隆形成能力;應(yīng)用劃痕修復(fù)實驗在不同時間點動態(tài)檢測不同組別肝癌細(xì)胞的遷移距離;Transwell法檢測不同組別肝癌細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù);應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測不同組別

5、肝癌細(xì)胞在不同細(xì)胞周期的凋亡分布以及對肝癌細(xì)胞周期變化的影響。
　　4.將攜帶RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)MSI2基因的肝癌細(xì)胞系;Westernblot法及Realtime PCR法檢測不同組別Wnt/β-catenin信號通路上重要開關(guān)分子β-catenin、LEF-1、TCF-4的活性變化。
　　三.MSI2在體內(nèi)實驗中對肝癌進(jìn)展的影響及調(diào)控機(jī)制研究
　　1.選擇4-6周齡的SPF級裸鼠為體內(nèi)實驗動物模型

6、，應(yīng)用分選的高表達(dá)MSI2基因的肝癌細(xì)胞系及轉(zhuǎn)染RNAi-MSI2的細(xì)胞系行細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后建立肝癌的皮下移植瘤模型，不同時間點動態(tài)觀察腫瘤大小、體積變化，繪制腫瘤生長曲線。
　　2.應(yīng)用上述建立的肝癌移植瘤模型，4周后切取腫瘤，拍照并測量腫瘤體積、重量，HE染色后對腫瘤內(nèi)肝癌細(xì)胞行病理分析;應(yīng)用Western blot及Realtime PCR法檢測肝癌移植瘤內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路上重要開關(guān)分子β-catenin、T

7、CF-4、LEF-1的活性變化。
　　結(jié)果：
　　一.MSI2在HCC中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義研究
　　1.MSI2表達(dá)上調(diào)與肝癌的進(jìn)展及術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)
　　2.MSI2在肝癌的表達(dá)與β-catenin的表達(dá)具有相關(guān)性
　　3.MSI2表達(dá)上調(diào)可預(yù)測肝癌術(shù)后患者不良預(yù)后
　　二.MSI2在體外實驗中對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究
　　1.MSI2在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)
　　2.M

8、SI2可增加肝癌細(xì)胞增殖活性
　　3.MSI2可促進(jìn)肝癌細(xì)胞克隆形成
　　4.MSI2可提高肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力
　　5.MSI2可抑制肝癌細(xì)胞早期凋亡
　　6.MSI2可改變肝癌細(xì)胞周期分布、促進(jìn)細(xì)胞增殖
　　7.MSI2可上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性
　　三.MSI2在體內(nèi)實驗中對肝癌進(jìn)展的影響及調(diào)控機(jī)制研究
　　1

9、.MSI2在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長
　　為了進(jìn)一步驗證MSI2對肝癌的作用及機(jī)制，我們采用SPF級4-6周齡裸鼠構(gòu)建肝癌皮下移植瘤模型，模擬人肝癌內(nèi)環(huán)境，以力求最客觀的驗證上述實驗結(jié)果;從繪制的腫瘤生長曲線中發(fā)現(xiàn)，MSI2 si-RNA組較Control組的腫瘤生長緩慢，但在最初10天內(nèi)觀察，兩組腫瘤體積無明顯差異，隨時間進(jìn)展，兩組腫瘤體積出現(xiàn)顯著差異;切取瘤體后測量腫瘤體積及重量發(fā)現(xiàn)，MSI2 si-RNA組與Control組腫瘤體積

10、及重量差異顯著;這說明MSI2可在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長。
　　2.MSI2可增加肝癌細(xì)胞異型性
　　為了觀察MSI2 si-RNA組及Control組皮下移植瘤的細(xì)胞形態(tài)變化，我們將兩組切取的腫瘤行HE染色，觀察大體病理發(fā)現(xiàn)，MSI2 si-RNA組肝癌細(xì)胞體積較小，細(xì)胞分化程度相對高，瘤體內(nèi)可見少量間質(zhì)成分分布，細(xì)胞的異型性小，并可見組織壞死;Control組肝癌細(xì)胞數(shù)量多，體積豐滿，呈巢狀分布，無明顯間質(zhì)成分可見，細(xì)胞核體積

11、大、分化差，細(xì)胞異型性程度高;這從微觀上說明MSI2可增加肝癌細(xì)胞異型性、提高肝癌惡性行為傾向。
　　3.MSI2可在體內(nèi)上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性
　　為了驗證MSI2在體內(nèi)對肝癌生長、進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步闡明MSI2對Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4活性變化的影響，我們應(yīng)用wester

12、n blot技術(shù)在蛋白水平上檢測了MSI2 si-RNA組及Control組裸鼠皮下移植瘤中MSI2、β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSI2表達(dá)沉默后，Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的表達(dá)明顯下調(diào);我們進(jìn)一步應(yīng)用realtime PCR法在轉(zhuǎn)錄水平檢測了MSI2 si-RNA組及Control組裸鼠皮下移植瘤中MSI2、β-catenin、L

13、EF-1及TCF-4的表達(dá)，結(jié)果顯示，MSI2表達(dá)沉默后，MSI2 si-RNA組β-catenin、LEF-1及TCF-4的表達(dá)較Control組明顯下調(diào);這在體內(nèi)實驗中進(jìn)一步驗證了MSI2對Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性影響;這說明MSI2可在體內(nèi)通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)肝癌進(jìn)展。
　　結(jié)論：
　　1.MSI2在乙肝病毒相關(guān)性肝癌中表達(dá)