聚乙烯亞胺-膽固醇結合脂質微泡介導基因轉染系統(tǒng)研究及應用.pdf

1、基因治療是通過插入治療基因至病變細胞內而產生特定功能的蛋白質或抑制異常基因表達,從而治療疾病的一種新方法。研究開發(fā)安全、高效、靶向的基因轉染系統(tǒng)是基因治療成功的關鍵,目前基因載體分為兩類:病毒載體和非病毒載體。非病毒載體因具有低免疫原性、能攜帶大分子量DNA及生物安全性高等優(yōu)點而倍受青睞。
　　 其中一種陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI,Polyethyenimine)受到廣泛關注。PEI有線型或分枝狀結構,有較高的陽性電荷,與帶

2、有陰性電荷的DNA或RNA結合能力較強,所形成的復合物可粘附到細胞表面被細胞內吞。PEI有很多質子化的多級氨的氮原子,當溶酶體內的pH下降時,PEI能夠大量捕獲質子,并引起Cl-內流,導致溶酶體滲透性腫脹,最后溶酶體破裂從而將內吞的DNA釋放到細胞質(即質子海綿效應),DNA釋放后進入細胞核中并表達。PEI的分子量的范圍變化很大,一般應用于基因轉染載體的PEI的分子量在5000～25000Da。高分子量的PEI基因轉染效率很高,如分枝狀

3、PEI25KDa,但毒性也很大。低分子量PEI毒性很低,但一般而言其基因轉染效率很低,并且PEI作為基因轉染載體直接體內應用會導致紅細胞的聚集,可以與血液中的白蛋白等非特異性結合,導致聚合體的形成,體內應用基因轉染效率低。
　　 所以需要對PEI進行改性。改性PEI的目的主要是降低PEI的毒性,提高PEI和DNA復合物的穩(wěn)定性,提高靶向性,減少與白蛋白的非特異性結合,延長體內的時間。
　　 研究目的:
　　 為了

4、探討不同分子量PEI接枝后性能和毒性的變化規(guī)律,本研究選擇低分子量和高分子量的PEI進行膽固醇接枝,合成一系列的不同氨基接枝率的聚合物,研究其細胞毒性、DNA壓縮性、緩沖性、抗核酸酶降解性,從而篩選合適的聚乙烯亞胺-膽固醇脂質聚合物；同時構建具有抗蛋白沉淀作用的中性脂質(聚乙二醇修飾)微泡,采用靜態(tài)自組裝技術把PEI-Chol/DNA復合物與脂質微泡融合,形成脂質微泡/PEI-Chol/DNA復合物,采用超聲定位達到靶向目的。最終構建高

5、效低毒的聚乙烯亞胺-膽固醇(Polyethyleneimine cholesterol,PEI-Chol)結合脂質微泡介導的基因轉染系統(tǒng),為臨床提供安全高效的給藥系統(tǒng)。
　　 研究方法和內容:分四大部分
　　 第一部分 聚乙烯亞胺一膽固醇聚合物的合成、表征與性能測試
　　 用膽固醇甲酰氯連接聚乙烯亞胺的氨基形成PEI-Chol脂質聚合物,分別用IR、1H-NMR、DSC對聚合物進行表征；采用酸堿滴定法結合公式β=

6、dC(HCl)/dpH計算聚合物的緩沖容量；采用熒光探針法測定聚合物的臨界膠束濃度(CMC)；并運用MTT比色法測定不同分子量、不同接枝率聚合物的細胞毒性。
　　 第二部分 PEI-Chol/DNA復合物的制備及生物物理性能表征
　　 采用堿裂解法,通過制備大腸桿菌感受態(tài)細胞、pEGFP-C1轉入和重組增殖、堿裂解法純化質粒等工序,提取質粒DNA；經瓊脂糖凝膠鑒定大小及純度。采用激光粒度儀測定PEI及PEI-Chol與p

7、EGFP-C1所形成的復合物的粒徑、Zeta電位；瓊脂糖凝膠電泳法考察PEI-Chol與DNA的結合能力,及其對DNA在核酸酶Ⅰ作用下的保護作用,掃描電鏡觀察復合物的形態(tài)。
　　 第三部分 脂質微泡/PEI-Chol/DNA自組裝系統(tǒng)的構建和性能測試
　　 采用反相揮發(fā)法,結合星點設計-球面效應法優(yōu)化脂質微泡制備的條件。以微泡濃度為指標,探討PEI-Chol聚合物種類、融合溫度和融合時間對微泡濃度的影響,激光粒度儀測定微

8、泡復合物的粒徑和Zeta電位。并分別從超聲對裸DNA完整性、超聲對微泡完整性,超聲對細胞生存率的影響等方面考察脂質微泡/PEI-Chol/DNA自組裝系統(tǒng)的安全性。
　　 第四部分 脂質微泡/PEI-Chol/DNA轉染系統(tǒng)的體外和體內轉染試驗
　　 研究了不同分子量PEI、PEI-Chol聚合物及其微泡介導的基因載體系統(tǒng)的基因轉染能力,通過以PEI-Chol(25-5)為對象,考察脂質微泡融合溫度、融合時間、N/P比和

9、超聲時間對DNA轉染效果的影響,確立轉染條件,運用流式細胞儀測定脂質微泡/PEI-Chol/DNA轉染系統(tǒng)在A549和MCF-7細胞中的轉染效果。此外,通過脂多糖(LPS)誘導和制備急性肺損傷(ALI)小鼠動物模型,探討脂質微泡/PEI-Chol/DNA轉染MIF siRNA對急性肺損傷小鼠的保護作用。
　　 結果:
　　 1.合成的PEI-Chol經IR檢測,圖譜上顯示PEI-Chol的羰基特征峰(1700cm-1),

10、表明聚乙烯亞胺與膽固醇成功連接,根據(jù)1H-NMR譜圖計算PEI的胺基接枝率,組成及分子量,達到試驗預期效果,表明反應可控。DSC圖譜顯示PEI連接膽固醇后剛性增強。
　　 2.同一分子量合成的PEI-Chol,其臨界膠束濃度(CMC)隨著膽固醇接枝量的增多,臨界膠束濃度逐漸下降。
　　 3.不同分子量的PEI,緩沖容量隨著分子量的增加而增大,同一分子量PEI合成的PEI-Chol,其緩沖容量隨著分子量的增加而減少。

11、>　　 4.聚合物對Hela、A549、MCF-7相對生長率影響的研究結果發(fā)現(xiàn):低分子量PEI未表現(xiàn)出明顯毒性,隨著分子量的增大,細胞毒性增強。接枝膽固醇可明顯降低PEI的細胞毒性,且接枝膽固醇的量越多,PEI的細胞毒性降低越顯著。
　　 5.采用堿裂解法制備及純化后的pEGFP-Cl純度和大小合適,質粒的A260/A280=1.89±0.025；分子量為4.7kb,濃度為279.37±0.971μg/ml。
　　 6

12、.低分子量PEI/DNA復合物的粒徑較大,接枝了膽固醇后壓縮DNA能力提高,抗酶能力增強；Zeta電位隨PEI分子量的增大而增大,接枝膽固醇可使Zeta電位下降；N/P越高,復合物的粒徑越小,Zeta電位增高。PEI-Chol與DNA能形成納米復合物。
　　 7.采用星點設計-球面效應法制備的微泡較穩(wěn)定,能穩(wěn)定半個月,粒徑分布均勻,Zeta電位-8.3mV,最佳制備條件為DPPC(X1)=40mg,PEI-Chol(X2)=7.

13、5mg,DSPE-PEG2000(X3)=4.5mg。微泡濃度為8.22×109個/ml。
　　 8.采用PEI-Chol(1.8-1)和PEI-Chol(25-5)融合制成的微泡復合物的微泡濃度高于PEI-Chol(10-1)和PEI-Chol(25-1)融合制成的微泡濃度,另外PEI-Chol制備的微泡復合物的Zeta電位明顯低于PEI-Chol/DNA復合物。
　　 9.超聲頻率2MHz、120s條件下,MI在1.

14、0范圍內,對A549細胞、MCF-7細胞的生存率以及DNA沒有有顯著影響,表明系統(tǒng)安全。
　　 10.轉染條件:融合溫度55℃,時間60min,超聲發(fā)射參數(shù):連續(xù)波,頻率2MHz,深度60mm,機械指數(shù)(mechanical index,MI)1.0,時間60s。細胞轉染實驗發(fā)現(xiàn):接枝膽固醇明顯提升PET1.8K的細胞轉染效果,如結合脂質微泡,轉染率和抗血清能力均有提高。
　　 11.成功構建以LPS刺激引起的小鼠肺損傷

15、動物模型,通過正常組、LPS刺激組,PC+LPS+MIF siRNA治療組(PEI-Chol轉染組)以及WP+LPS+MIF siRNA(微泡轉染組)等四組之間的對比研究,發(fā)現(xiàn)模型組肺組織病理變化明顯,而PC+LPS+MIF siRNA治療組無明顯的治療作用,而WP+LPS+MIF siRNA治療組能有效改善組織病理變化,并且能有效降低炎癥介質TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平,闡明本基因轉染系統(tǒng)是有效。
　　 結論:

16、r>　　 1.合成的PEI-Chol聚合物具有以下物理學特點:合適的膽固醇接枝率對緩沖容量影響少,膽固醇基團的引入可改變PEI的親水性和親油性,有助于膠束的形成。從而為選擇合適的接枝率的PEI-Chol提供依據(jù)。
　　 2.合成的PEI-Chol聚合物具有以下生理學特點:接枝膽固醇可有效降低PEI的細胞毒性,并且能有效提高低分子量PEI對DNA的壓縮性能,提高其抗核酸酶作用,對DNA具有保護作用。
　　 3.以PEI-