乙型肝炎病毒L納米顆粒作為一種新型載體用于肝癌靶向性基因與藥物治療.pdf

1、第一部分乙型肝炎病毒L顆粒的真核表達(dá)和純化鑒定 目的：利用一種基因工程質(zhì)粒pSVsigLM-S-表達(dá)和純化乙肝病毒L顆粒，并鑒定其理化性質(zhì)和抗原性。 方法：重組質(zhì)粒pSVsigLM-S-采用DEAE—葡聚糖法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，培養(yǎng)上清通過澄清、PEG6000濃縮沉淀、Cscl等密度超速離心、蔗糖密度梯度超速離心分離純化L顆粒。通過SDS-PAGE和Westernblotting技術(shù)檢測(cè)純化蛋白的分子量以及蛋白的抗原性

2、。BCA法和RIA法分別確定總蛋白和L蛋白濃度，并計(jì)算純度。透射電子顯微鏡(TEM)及原子力顯微鏡(AFM)觀測(cè)不同條件下L顆粒的物理形態(tài)。 結(jié)果：通過超速離心技術(shù)結(jié)合ELISA法成功純化具有S抗原性的蛋白顆粒。SDS-PAGE和Westernblotting證實(shí)純化蛋白同時(shí)具有PreS1抗原性，為分子量約42KD的糖基化L蛋白，純化產(chǎn)物中L蛋白純度＞90％。透視電鏡顯示L蛋白能自組裝成直徑約23nm的球形顆粒，AFM顯示在液態(tài)

3、環(huán)境中L顆粒的平均直徑約180nm，高濃度下能聚集成直徑約8μm的樹枝狀結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：通過在L編碼基因的氨基端融合外源性信號(hào)肽編碼序列，能有效的引導(dǎo)L蛋白穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，L蛋白自組裝成顆粒并分泌到培養(yǎng)基質(zhì)。超速離心技術(shù)能有效的純化L顆粒并保持其生物學(xué)活性和物理結(jié)構(gòu)。 第二部分乙型肝炎病毒L納米顆粒用于肝癌靶向性基因治療轉(zhuǎn)運(yùn)載體的體外實(shí)驗(yàn) 目的：將外源基因?qū)胍腋尾《綥納米顆粒，以檢測(cè)L顆粒用作肝癌靶向性基因治療轉(zhuǎn)運(yùn)

4、載體的可行性。 方法：通過電穿孔方法將熒光表達(dá)質(zhì)粒pGFP導(dǎo)入L顆粒，形成的L/pGFP顆粒轉(zhuǎn)染各種肝來源細(xì)胞系及非肝來源細(xì)胞系，未經(jīng)過電穿孔的pGFP與L顆粒的混合物作為對(duì)照組同時(shí)轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞系。通過熒光顯微鏡比較兩者的轉(zhuǎn)染效率和特異性。 結(jié)果：電穿孔能有效的將GFP質(zhì)粒導(dǎo)入L顆粒，在電壓=400V，脈沖時(shí)間=60μs，pGFP:L顆粒=4:10的條件下，L/pGFP顆粒能得到最大的轉(zhuǎn)染效果。L/pGFP顆粒對(duì)各種肝來

5、源細(xì)胞系均保持較高的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)正常肝來源細(xì)胞L02的轉(zhuǎn)染效率低于肝癌細(xì)胞系HepG2和7721，然而均顯著高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率(P＜0.05)。非肝來源的乳腺癌和淋巴瘤細(xì)胞系不能被L/pGFP顆粒有效轉(zhuǎn)染。 結(jié)論：電穿孔方法能有效的將外源核酸導(dǎo)入L顆粒而不破壞其物理特性以及與肝細(xì)胞的結(jié)合能力。攜帶外源性基因的L顆粒能特異性、高效率轉(zhuǎn)染各種肝來源細(xì)胞，可作為一種安全高效的靶向性轉(zhuǎn)運(yùn)載體用于肝癌的基因治療。 第三部分乙型肝炎

6、病毒L納米顆粒聯(lián)合化療藥物阿霉素作為肝癌靶向性給藥系統(tǒng)的研究 目的：化療藥物阿霉素導(dǎo)入乙肝病毒L納米顆粒，以檢測(cè)L顆粒用作肝癌靶向性給藥系統(tǒng)的可行性。 方法：通過電穿孔方法將化療藥物阿霉素導(dǎo)入L顆粒，形成的L/阿霉素轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞系。未經(jīng)過電穿孔的阿霉素與L顆粒的混合物作為對(duì)照組同時(shí)轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞系。通過MTT法、Hoechst染色、熒光分光光度計(jì)比較兩者對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡的影響以及細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的變化。

7、 結(jié)果：L/阿霉素能顯著抑制HepG2的生長(zhǎng)；在化療藥物總量相同的條件下，L/阿霉素處理組細(xì)胞凋亡率(44.6±3.5％)明顯高于阿霉素組(19.5±2.4％)及阿霉素與L顆粒的混合組(20.4±2.7％)；熒光分光光度計(jì)檢測(cè)表明L/阿霉素處理組胞內(nèi)化療藥物濃度顯著高于阿霉素組(P＜0.05)。 結(jié)論：電穿孔方法能有效的將化療藥物阿霉素導(dǎo)入L顆粒，L顆粒與阿霉素混合液經(jīng)電穿孔后能顯著提高阿霉素的胞內(nèi)藥物濃度，抑制肝癌細(xì)胞的生