小鼠胚泡圍著床期LongSAGE文庫構(gòu)建及相關(guān)基因研究.pdf

1、胚胎著床是人和哺乳動(dòng)物生殖過程中妊娠建立的第一步，是決定妊娠成功與否的關(guān)鍵。成功的植入取決于處于接受態(tài)的子宮內(nèi)膜和具有侵入性的胚胎間的同步協(xié)調(diào)反應(yīng)。在植入開始，母體與胚胎建立了密切的物質(zhì)和信息交流。目前認(rèn)為有多種分子和細(xì)胞水平的調(diào)控分子如內(nèi)分泌、旁分泌、鄰分泌調(diào)節(jié)因子參與胚胎的著床過程，并通過多種細(xì)胞信號途徑從時(shí)間和空間上對胚胎和子宮進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。但是子宮內(nèi)膜僅在某一特定時(shí)期允許胚胎著床，這一時(shí)期時(shí)間很短，代表著子宮內(nèi)膜對胚胎具有容受性

2、，稱為“著床窗口期”。胚胎著床過程包括脫去透明帶、定位、黏附、侵入到最后著床等幾個(gè)階段。由于涉及到眾多基因的調(diào)控以及錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子網(wǎng)絡(luò)的參與，早期的胚胎發(fā)育和著床的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚。 幾乎所有生物學(xué)變化都與關(guān)鍵基因的表達(dá)有關(guān)。人們以往一直試圖從某一特定的分子與基因作為突破口，探尋著床發(fā)生機(jī)制。現(xiàn)在大規(guī)模的基因表達(dá)譜分析已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，其中寡核苷酸芯片、DNA微陣列以及基因表達(dá)系列分析是目前應(yīng)用最廣泛的基

3、因表達(dá)分析方法。但DNA微陣列只能檢測已知基因，且定量分析受到限制，而SAGE技術(shù)能較完整地獲得基因組表達(dá)豐度的數(shù)量信息，能夠大規(guī)模對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定性和定量分析，可充分了解基因轉(zhuǎn)錄組的全貌，甚至可以發(fā)現(xiàn)新基因，被證明是一種對全基因組基因進(jìn)行表達(dá)分析和尋找差異表達(dá)基因的強(qiáng)有力工具。通過對轉(zhuǎn)錄本特定位置的短寡核苷酸標(biāo)簽(即SAGE標(biāo)簽)的鑒定、分析可以獲取基因表達(dá)的信息。將所有SAGE標(biāo)簽從cDNA中分離出來制備成一個(gè)SAGE標(biāo)簽庫，然后連接

4、成串聯(lián)體進(jìn)行克隆測序，將得到的短序列核苷酸順序以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式進(jìn)行處理，就能對數(shù)以干計(jì)的mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析，每種標(biāo)簽在全部標(biāo)簽中所占的比例可以反映它所代表的轉(zhuǎn)錄本在整個(gè)轉(zhuǎn)錄體系中的表達(dá)豐度。因此，SAGE技術(shù)可以用來準(zhǔn)確地對特定組織的基因表達(dá)進(jìn)行定性和定量分析。 SAGE的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以在整體水平對細(xì)胞或組織中的大量轉(zhuǎn)錄本同時(shí)進(jìn)行定量分析，而無論其是否為已知基因。因而，可以客觀、全面地反映基因轉(zhuǎn)錄組的全貌。迄今為止，國內(nèi)外尚

5、無反映著床前期(妊娠第3天，d3)與著床期(妊娠第5天，d5)子宮內(nèi)膜基因表達(dá)變化規(guī)律的相關(guān)報(bào)道。因而，我們根據(jù)LongSAGE的方法分別構(gòu)建小鼠胚泡著床前期與著床期子宮內(nèi)膜LongSAGE基因表達(dá)文庫，并對兩個(gè)LongSAGE標(biāo)簽庫進(jìn)行定性和定量分析，以獲取與胚泡著床明顯相關(guān)的差異表達(dá)基因，并探討這些差異表達(dá)基因在小鼠胚泡著床過程中可能的作用機(jī)制，為最終闡明胚泡著床分子作用機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。 經(jīng)過鑒定確認(rèn)，從構(gòu)建好的著床

6、前期(d3)LongSAGE標(biāo)簽庫中挑選克隆¨3個(gè)，進(jìn)行測序，測序一共得到標(biāo)簽1697個(gè)，特異性標(biāo)簽為1222個(gè)，其中單一匹配標(biāo)簽625個(gè)，占51％，多重匹配標(biāo)簽305個(gè)，占25％：新標(biāo)簽293個(gè)，占24％。從構(gòu)建好的著床期(d5)LongSAGE標(biāo)簽庫中挑選克隆330個(gè)，進(jìn)行測序，測序一共得到標(biāo)簽4988個(gè)，特異性標(biāo)簽為4842個(gè)，其中單一匹配標(biāo)簽2093個(gè)，占43％，多重匹配標(biāo)簽759個(gè)，占16％；新標(biāo)簽1990個(gè)，占41％。將構(gòu)建

7、好的d3與d5兩個(gè)時(shí)期的LongSAGE標(biāo)簽庫用軟件分析、比對，發(fā)現(xiàn)兩者之間基因表達(dá)存在明顯差異。根據(jù)著床期和著床前期LongSAGE標(biāo)簽表達(dá)豐度相互之間的比值，在著床期有597個(gè)標(biāo)簽下調(diào)表達(dá)超過2倍、938個(gè)標(biāo)簽上調(diào)表達(dá)超過2倍；有277個(gè)標(biāo)簽(d5)和445個(gè)標(biāo)簽(d3)各自上調(diào)幅度超過5倍；著床前期和著床期比值(d3／d5)超過10倍的有275個(gè)標(biāo)簽，而著床期和著床前期比值(d5／d3)超過10倍的有110個(gè)標(biāo)簽。 研究表

8、明，許多差異基因的表達(dá)與以下作用的調(diào)節(jié)有關(guān)，包括催化作用、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)生物合成及修飾、分解代謝、水解作用、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、營養(yǎng)運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)與發(fā)生、細(xì)胞擴(kuò)散、細(xì)胞分化、凋亡與抗凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫防御反應(yīng)、抗原遞呈、核糖體發(fā)生、RNA加工處理、RNA結(jié)合、mRNA代謝、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制以及胚胎發(fā)育等。 通過對兩個(gè)LongSAGE基因標(biāo)簽文

9、庫進(jìn)行分析、比較，我們可獲得某一基因在胚胎著床的某一特定階段可能作用機(jī)制的相關(guān)信息。結(jié)果顯示，有17個(gè)標(biāo)簽在著床前期表達(dá)水平顯著高于著床期(大于25倍)，包括Rps18(ribosomalproteinS18)，Rpll3(ribosomalproteinU3)，Cyp39a1，Sp／nk3(serinepeptidaseinhibitor,Kazaltype3)，Subl(SUBlhomolog)，SlOOa6(S1.00calciu

10、mbindingproteinA6,calcyclin)，Tmsbl0(Thymosin，beta1O，mRNA)，Transcribedlocus(moderatelysimilartoNP705892．1signalpeptidase2lkDasubunit)，Setbp19(SerpinelmRNAbindingprotein1)，Rp／27a(ribosomalproteinL27a)，Cizl(CDKNlAinteractin

11、gzincfingerprotein1)，Itgbl(Integrinbeta1，mRNA)，Cnn3(Calponin3，acidic，mRNA)，Tcpll(t-complexprotein11)，Pdcdl0(programmedcelldeath1O)，4921517L17Rik(RIKENcDNA4921517U7gene)，Tsen34(tRNAsplicingendonuclease34homolog)。這些基因及其編碼產(chǎn)

12、物可能參與以下過程的調(diào)節(jié)：新陳代謝、RNA加工處理、mRNA加工處理、蛋白質(zhì)生物合成、核糖體發(fā)生、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、細(xì) 胞擴(kuò)散、細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。我們認(rèn)為，這些基因在著床前期子宮內(nèi)膜容受性形成過程中可能扮演了非常關(guān)鍵的角色。 另有以下5個(gè)LongSAGE標(biāo)簽在著床期基因表達(dá)水平明顯高于著床前期(大于20倍)：Cybb(cytochromeb-245，b

13、etapolypeptide)，Ig／bp7(Insulin-likegrowthfactorbindingprotein7，mRNA)，Polr2b(DNAdirectedRNApolymeraseIIpolypeptideB)，Tpt，(tumorprotein，translationally-controlled1)，Rps4x(ribosomalproteinS4，X-linked)。這些基因的表達(dá)可能與以下調(diào)節(jié)有關(guān)：新陳代謝、

14、細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、細(xì)胞擴(kuò)散、轉(zhuǎn)錄、凋亡與抗凋亡、蛋白質(zhì)生物合成以及蛋白質(zhì)定位等。新標(biāo)簽AGGGCTTGGGGATCGAG、ATATGTGATATCGAGT和CCTAGTAATCGGAAGCC在著床前期(d3)表達(dá)水平顯著升高(比著床期至少升高12倍)，同樣，新標(biāo)簽ATACTGACTGACATTTTGTAG和TAGATATAGGCTTACTA在著床期高表達(dá)(與著床前期相比，升高4～5倍)。所以，這些基因?qū)Υ龠M(jìn)著床發(fā)生、確保著床順利進(jìn)行可

15、能發(fā)揮了重要作用。盡管如此，目前我們的研究還無法解釋這些基因在小鼠胚胎著床過程中具體的功能和作用機(jī)制，需要我們作進(jìn)一步的研究。 一些對小鼠胚胎著床有重要作用的調(diào)節(jié)因子，如白血病抑制因子(LIF)、環(huán)氧化酶2(COX2)和微粒體前列腺素合酶1在我們的實(shí)驗(yàn)中未被檢測到。其原因可能是由于這些基因在小鼠子宮特定部位的限制性表達(dá)所致。如LIF、COX2和微粒體前列腺素合酶．1只限于植入位點(diǎn)亞腔基質(zhì)細(xì)胞(subluminalstromalc

16、ell)薄層處表達(dá)，COX2只在胚泡植入位點(diǎn)周圍的腔上皮(1uminalepithelium)和亞腔基質(zhì)細(xì)胞(subluminalstromalcell)處表達(dá)。然而在整個(gè)子宮，腔上皮占5—1O％，基質(zhì)占30-35％，子宮肌層占60-65％。這個(gè)問題可望通過聯(lián)合應(yīng)用SAGE和激光捕捉顯微(1asercapturemicrodissection，LCM)技術(shù)加以解決。另外，某些基因轉(zhuǎn)錄本(約O．7％)由于不含有錨定酶NlalII酶切位點(diǎn)因